Computational design and synthesis of molecules for application in antimicrobial therapies

Abstract

The work presented in this PhD thesis is focused on the development of alternative antimicrobial therapies and new molecules for the inactivation of Escherichia coli, whose infections by multi-drug resistant (MDR) strains are a major concern for healthcare systems. These studies include potentiation of ciprofloxacin’s antibacterial activity through the use of photodynamic inactivation (PDI) and the synthesis of potential E. coli DNA gyrase B inhibitors, guided by computer-aided drug design (CADD) tools. In Chapter 1, a summary of the scientific challenges associated with infections by MDR microorganisms is given, with particular focus on E. coli, together with a brief overview on the prospects of CADD for the development of new antimicrobials. Then, a critical analysis of the state of the art on the biological role of the bacterial DNA gyrase and enzyme inhibitors is presented. Finally, a brief outline of PDI and its combination with antibiotics for the management of topical infections is presented. The first part of Chapter 2 describes the optimization of synthetic methods, using sustainable alternative reaction activation technologies (microwave and ultrasound irradiation) for preparation of cationic photosensitizers (PS). Under the newly developed conditions, cationic imidazolyl phthalocyanines (IPc-Zn-Et4+, IPc-In-Et4+) and porphyrins (IP-H-Me2+, IP-H-Me4+, IP-Zn-Me4+) were obtained with yields up to 59%, 63%, 95%, 92% and 90%, respectively. In the second part of Chapter 2, structure-activity studies using these cationic photosensitizers in the photoinactivation of E. coli through PDI and its combination with ciprofloxacin (dual phototherapy) were performed. The effects of the cationic macrocycle structure (i.e. porphyrin or phthalocyanine-based), number of positive charges, coordinating central metal and amphiphilicity were evaluated. Overall, in PDI monotherapy all photosensitizers were active against E. coli in the nM concentration range even using very low light doses (1.8 J/cm2). The best outcome was obtained with the tetra-cationic porphyrin family (IP-H-Me4+ and IP-Zn-Me4+) where 5 log CFU E. coli reduction was achieved, at 32 nM PS concentration and 1.8 J/cm2 light dose. Then, aiming to achieve a synergistic effect between the combination of PDI with ciprofloxacin (CIP) an optimization of dual phototherapy protocol was carried out. The best result of this therapy for E. coli inhibition was achieved when PDI using IP-H-Me4+ as photosensitizer at 16 nM concentration and 5.4 J/cm2 light dose was followed by CIP administration (0.004 mg/L). This is a remarkable result that potentiated CIP antimicrobial activity, requiring 64-fold less CIP concentration (reduction from 0.25 mg/L – monotherapy to 0.004 mg/L – dual phototherapy) to achieve full E. coli inhibition. The dual phototherapy studies proceeded with the transposition to in vivo studies, for the treatment of mice wounds infected with E. coli. The animal studies revealed that the combination therapy (PDI + CIP) was more efficient than each individual monotherapy (PDI or CIP) both in the inactivation of bacteria and improvement of wound healing. Chapter 3 describes the use of CADD tools (i.e. pharmacophore modeling and molecular docking) for the discovery of potential new inhibitors of the E. coli’s DNA gyrase B subunit. Firstly, optimized pharmacophore models were constructed based on the structural and biological data of known inhibitors reported in literature. Their performance in discriminating between active and inactive compounds was assessed, revealing a > 90% true active hit rate and a < 10% false positive rate. The pharmacophore models were combined with molecular docking (ChemScore function from GOLD software) to screen the National Cancer Institute (NCI) database and the most six promising structures were selected for biological evaluation. In parallel, both CADD tools were used to screen a virtually designed set of new derivatives of 2-(2-aminophenyl)-5(6)-substituted-1H-benzimidazoles, which led to the selection of three promising molecules to pursue their chemical synthesis: 2-(2-aminophenyl)-5(6)-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-benzimidazole (3.14), 2-(2-aminophenyl)-5(6)-(3-fluoro-4-(methoxycarbonyl)phenyl)-1H-benzimidazole (3.15), 2-(2-aminophenyl)-N-(3-(methylsulfonyl)phenyl)-1H-benzimidazol-5(6)-amine (3.16). The preparation of such compounds encompassed condensation of 4-bromo-1,2-diaminobenzene with 2-nitrobenzaldehyde to give the base scaffold 5(6)-bromo-2-(2-nitrophenyl)-1H-benzimidazole 3.1 with 62% yield in multi-gram scale. After benzimidazole NH protection, the 5(6) position was modulated through Pd-catalyzed coupling reactions, namely Suzuki-Miyaura (yields up to 72%) and Buchwald-Hartwig (yield up to 81%). Finally, Pd-catalyzed hydrogenation allowed to obtain the desired compounds 3.14 - 3.16 in yields up to 91%. Methylation of 3.11 in DMF gave the cationic 1,3-dimethyl-5(6)-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2-(2-nitrophenyl)-1H-benzimidazol-3-ium iodide (3.17) in 96% yield. Both the synthesized molecules and the ones supplied by NCI were evaluated in DNA gyrase and E. coli inhibition, but no activity was detected with concentrations lower than 100 µM and 250 mg/L, respectively. Nevertheless, some compounds acquired from NCI (number 647083, NCI-4) and from the newly synthesized benzimidazole family (3.17) displayed appreciable Staphylococcus aureus antimicrobial activity, with minimum inhibitory concentration (MIC) values of 42 and 125 mg/L, respectively. In Chapter 4, the experimental procedures and full compound characterization are presented.

O trabalho apresentado nesta tese de doutoramento é centrado no desenvolvimento de terapias antimicrobianas alternativas e novas moléculas para a inativação de Escherichia coli, cujas infeções por estirpes multirresistentes (MDR) são uma grande preocupação para os sistemas de saúde. Os estudos efetuados incluem a potenciação da atividade antibacteriana da ciprofloxacina através do uso da inativação fotodinâmica (PDI) e a síntese de potenciais inibidores da E. coli DNA girase, guiada por ferramentas de design de fármacos assistida por computador (CADD). No Capítulo 1 encontra-se um resumo dos desafios científicos associados a infeções por microrganismos do tipo MDR, com um foco particular na E. coli, juntamente com uma visão geral sobre as perspetivas do CADD para o desenvolvimento de novos antibacterianos. De seguida, é apresentada uma análise crítica do estado da arte sobre o papel biológico da DNA girase bacteriana e seus inibidores. Finalmente, é apresentado um breve sumário da PDI e da sua combinação com antibióticos para aplicação no tratamento de infeções tópicas. A primeira parte do Capítulo 2 descreve a otimização de métodos sintéticos através de tecnologias sustentáveis para a ativação de reações (irradiação de micro-ondas e ultrassons) para a preparação de fotossensibilizadores (PS) catiónicos. Sob as condições desenvolvidas, ftalocianinas (IPc-Zn-Et4+, IPc-In-Et4+) e porfirinas (IP-H-Me2+, IP-H-Me4+, IP-Zn-Me4+) do tipo imidazolil catiónicas foram obtidas com rendimentos até 59%, 63%, 95%, 92% e 90%, respetivamente. Na segunda parte do Capítulo 2 são apresentados estudos de estrutura-atividade utilizando estes fotossensibilizadores catiónicos na fotoinativação da E. coli, utilizando PDI e a sua combinação com ciprofloxacina (fototerapia dual). Foi avaliado o efeito da estrutura do macrociclo (porfirina ou ftalocianina), número de cargas positivas, metal central e anfifilicidade. De um modo geral, todos fotossensibilizadores foram ativos na fotoinativação de E. coli em concentrações na ordem dos nM e usando doses de luz muito baixas (1.8 J/cm2). O melhor resultado foi obtido com a família de porfirinas tetra-catiónicas (IP-H-Me4+ e IP-Zn-Me4+), com a quais foi obtida uma redução em 5 log de unidades formadoras de colónias (UFC) de E. coli, utilizando 32 nM de PS e uma dose de luz de 1.8 J/cm2. Posteriormente, foi efetuada uma otimização do protocolo de fototerapia dual, tendo em vista alcançar um efeito sinérgico entre a combinação de PDI com ciprofloxacina (CIP). O melhor resultado em fototerapia dual para a inativação de E. coli foi alcançado usando IP-H-Me4+ como PS, numa concentração de 16 nM e dose de luz de 5.4 J/cm2, seguido da administração de CIP (0.004 mg/L). Este é um resultado notável, conduzindo à potenciação da atividade da CIP, sendo necessária uma concentração de CIP 64 vezes inferior (redução de 0.25 mg/L – monoterapia para 0.004 mg/L – fototerapia dual) para a inibição total de E. coli. Os estudos de fototerapia dual prosseguiram com a transposição para estudos in vivo, no tratamento de feridas de murganho infetadas com E. coli. Os estudos em animais evidenciaram a eficiência da fototerapia dual (PDI + CIP) quando comparado com as monoterapias individuais (PDI ou CIP), tanto na inativação de bactérias, como na melhoria da cicatrização das feridas. O Capítulo 3 descreve o uso de ferramentas CADD (i.e. modelos de farmacóforo e docking molecular) para a descoberta de novos potenciais inibidores da subunidade B da E. coli DNA gyrase. Em primeiro, foram construídos modelos de farmacóforo otimizados, baseados em informações estruturais e biológicas de inibidores reportados na literatura. O seu desempenho em distinguir entre moléculas ativas e inativas foi avaliado, revelando uma taxa > 90% na identificação de ativos e < 10% de falsos positivos. Os modelos de farmacóforo foram combinados com docking (função de ChemScore do software GOLD) para filtrar a base de dados do National Cancer Institute (NCI) e as seis moléculas mais promissoras foram selecionadas para avaliação biológica. Em paralelo, as ferramentas de CADD foram utilizadas para filtrar uma base de dados de novos derivados de 2-(2-aminofenil)-5(6)-substituídos-1H-benzimidazoles desenhados virtualmente, levando assim à seleção de três moléculas promissoras para prosseguir com a sua síntese química: 2-(2-aminofenil)-5(6)-(3,4,5-trimetoxifenil)-1H-benzimidazole (3.14), 2-(2-aminofenil)-5(6)-(3-fluoro-4-(metoxicarbonil)fenil)-1H-benzimidazole (3.15), 2-(2-aminofenil)-N-(3-(metilsulfonil)fenil)-1H-benzimidazol-5(6)-amina (3.16). A preparação destes compostos envolveu a condensação do 4-bromo-1,2-diaminobenzeno com 2-nitrobenzaldeído, obtendo-se a molécula base 5(6)-bromo-2-(2-nitrofenil)-1H-benzimidazole 3.1 na escala de multi-grama, com 62% de rendimento. Após proteção do grupo NH do benzimidazole, a posição 5(6) foi modulada através de reações de acoplamento catalisadas por Pd, nomeadamente do tipo Suzuki-Miyaura (rendimentos até 72%) e Buchwald-Hartwig (rendimentos até 81%). Finalmente, os compostos idealizados 3.14 - 3.16 foram obtidos com rendimentos até 91%, mediante hidrogenação com Pd. A metilação de 3.11 em DMF permitiu obter o composto catiónico iodeto de 1,3-dimetil-5(6)-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-(2-nitrofenil)-1H-benzimidazol-3-io (3.17) com 96% de rendimento. Tanto as moléculas sintetizadas como as fornecidas pelo NCI foram avaliadas na inibição da DNA girase e de E. coli, no entanto não foi observada atividade em concentrações abaixo de 100 µM e 250 mg/L, respetivamente. No entanto, alguns compostos do NCI (número 647083, NCI-4) e da nova família de benzimidazóis recém-sintetizados (3.17) demonstraram uma atividade antimicrobiana significativa contra Staphylococcus aureus, com valores de concentração mínima inibitória (CMI) de 42 e 125 mg/L, respetivamente. No Capítulo 4, são apresentados os procedimentos experimentais e a caracterização completa dos compostos sintetizados.