The role of polyploidy in shaping the diversity within Linum suffruticosum s.l. (Linaceae)

Abstract

Whole genome duplications (WGDs) bear broad-scale consequences on gene expression and developmental processes, potentially leading to immediate morphological, reproductive and physiological shifts. Changes in reproductive traits will be particularly relevant in species with complex breeding systems, such as heterostyly, a polymorphism that promotes outcrossing and reduces sexual self-interference. Cytotypes frequently have distinct characteristics that allow to grow in habitats different from their parentals and/or expand to new areas, leading to spatial segregation. In the Mediterranean region, the high frequency of polyploidy is likely a consequence of its dynamic paleogeographic and climatic history. Despite the advances in the genetic and epigenetic consequences of WGDs, the ecological factors driving polyploidy and its evolutionary consequences are poorly understood. The main goal of this study was to evaluate the role of WGDs as one of the factors shaping the evolution of flowering plants, using Linum suffruticosum s.l. as study system. This species complex comprises heterostylous populations with long- and short-styled morphs individuals and a heteromorphic self-incompatibility system. It was also described as a polyploid complex, but nothing was known about its current cytogeographical patterns. First, I have focused on the cytogenetic and cytogeographical patterns, then, on the impacts of WGDs on environmental attributes and the reproductive morphology and reproductive system, and, finally, on the phylogenetic and phylogeographic relationships among cytotypes. Using flow cytometric analyses and chromosome counts, I investigated cytotypes diversity and distribution patterns in most of the distribution range. High cytogenetic diversity was found with five major cytotypes being detected (diploids, tetraploids, hexaploids, octoploids and decaploids) and new ploidy levels were reported for the first time. The different ploidy levels were distributed parapatrically with several contact zones, and a few mixed-ploidy populations were observed. These results showed that WGDs are one of the key mechanisms governing the diversification of L. suffruticosum s.l. The environmental niches of the five main cytotypes were studied across the distribution range, using niche modelling tools. Differences in the ecological requirements were observed, with polyploids being associated with dry and harhs habitat. Diploids presented the widest environmental niche, with polyploids occupying part of the diploid niche. Although some polyploids have equivalent potential ecological niches, the cooccurrence of cytotypes was not frequent in nature. The different ecological requirements could not entirely explain the distribution of cytotypes, but they have played a role in the mosaic distribution of ploidy levels of L. suffruticosum s.l. To evaluate the impact of WGDs on reproductive traits and reproductive relationships, morph frequencies were recorded, and the sexual organs were measured in flowers from populations of each cytotype. Crosses within cytotypes (selfing, and intra- and inter-morph crosses) and crosses between diploids and tetraploids were performed. Most of the populations were isoplethic, and the reciprocity indexes were maintained in all cytotypes. The size of sexual organs increased with ploidy level, and there was an overlap in reciprocal positions among cytotypes. Linum. suffruticosum s.l. was strongly self- morph incompatible across all ploidy levels. However, crosses between diploid and tetraploids produced similar pollen tube development to intra-cytotype crosses. These results suggest that pollen and gene flow is possible among cytotypes and that such flow is prevented by geographical distance between populations. Finally, DNA extractions from populations of all cytotypes were made and plastid and nuclear markers were used to estimate a haplotype-ribotype network and infer the phylogenetic and phylogeographic relationships among the cytotypes. Much higher variability of ribotypes and haplotypes were found in diploid populations from the east Pyrenees to northern Italy than in diploid and polyploid populations from Spain and Morocco. These results showed that several WGDs and differentiation events occurred along the distribution area. In conclusion, the geographical overlap and high cytogenetic diversity suggest multiple origins of the polyploids. The ecological requirements played a role in the mosaic distribution of cytotypes, and the results provide solid data for future reciprocal experiments. There is no evidence of the breakdown of the incompatibility system, but pollen flow between cytotypes appears to be possible. Despite the impossibility to disentangle the origin of polyploids, the diversity observed provides valuable data for future phylogeny and phylogeography studies and should be accounted for when studying this complex's biosystematics.

As duplicações do genoma podem ter consequências em larga escala na expressão genética e nos processos de desenvolvimento, podendo levar a potenciais alterações morfológicas, reprodutivas e fisiológicas imediatas. Alterações nas características reprodutivas são particularmente relevantes em espécies com sistemas de reprodução complexos, como a heterostilia, um polimorfismo que promove a polinização cruzada e reduz a interferência dos órgãos sexuais. Os citotipos novos apresentam, frequentemente, características distintas que lhes permitem crescer em habitats diferentes dos seus progenitores e/ou expandirem-se para novas áreas, levando à segregação espacial. Na região do Mediterrâneo, a alta frequência de poliploidia é provavelmente consequência da uma história dinâmica paleogeográfica e climática. Apesar dos avanços nas consequências genéticas e epigenéticas das duplicações de genoma, os fatores ecológicos que conduzem à poliploidia e as suas consequências evolutivas são ainda pouco compreendidos. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o papel das duplicações do genoma como um dos fatores que influenciam a evolução das angiospérmicas, usando Linum suffruticosum s.l. como sistema de estudo. Este complexo de espécies é composto por populações heterostilas com indivíduos de morfotipos longos e curtos e um sistema de auto-incompatibilidade heteromórfica. Também foi descrito como um complexo poliploide, mas pouco se sabia sobre os seus padrões citogeográficos atuais. Primeiro, foquei-me nos padrões citogenéticos e citogeográficos, depois nos impactos das duplicações do genoma nos atributos ambientais e na morfologia reprodutiva e sistema reprodutivo e, por fim, nas relações filogenéticas e filogeográficas entre citotipos. Usando a citometria de fluxo e contagens cromossómicas, investiguei a diversidade de citotipos e os padrões de distribuição na maior parte da área de distribuição. Foi encontrada uma elevada diversidade citogenética, com cinco citotipos principais detectados (diploides, tetraploides, hexaploides, octoploides e decaploides) e a descoberta de novos níveis de ploidia. Os diferentes níveis de ploidia distribuíram-se parapatricamente com várias zonas de contato, e foram detetadas algumas populações de vários citotipos. Esses resultados mostraram que as duplicações do genoma são um dos principais mecanismos que influenciam a diversificação de L. suffruticosum s.l. Os nichos ambientais dos cinco principais citotipos foram estudados em toda a área de distribuição, usando ferramentas de modelação de nicho. Foram observadas diferenças nos atributos ecológicos, com os poliploides a serem associados a habitats secos e agrestes. Os diploides apresentaram o nicho ambiental mais amplo, com os poliploides a ocupar parte do nicho diploide. Embora alguns poliploides tenham nichos ecológicos potenciais equivalentes, a coocorrência de citotipos não é frequente na natureza. As diferentes exigências ecológicas não podem explicar inteiramente a distribuição dos citotipos, mas desempenharam um papel na distribuição em mosaico dos níveis de ploidia de L. suffruticosum s.l. Para avaliar o impacto das duplicações do genoma nas características reprodutivas e relações reprodutivas, frequências de morfotipos foram registadas e os órgãos sexuais foram medidos em flores de populações de cada citotipo. Cruzamentos dentro de citotipos (autopolinização, e cruzamentos intra- e inter-morfos) e cruzamentos entre diploides e tetraploides foram realizados. A maioria das populações demonstrou ser isoplética e os índices de reciprocidade foram mantidos em todos os citotipos. O tamanho dos órgãos sexuais aumentou com o nível de ploidia e houve sobreposição nas posições recíprocas entre os citotipos. Linum suffruticosum s.l. é fortemente auto- e morfo-incompatível em todos os níveis de ploidia. No entanto, nos cruzamentos entre diploides e tetraploides foi obtido um desenvolvimento de tubos polínicos semelhante aos cruzamentos intra-citotipo. Estes resultados sugerem que o fluxo genético e de pólen é possível entre citótipos e que este fluxo é evitado pela distância geográfica entre as populações. Finalmente, extrações de ADN de populações de todos os citotipos foram realizadas e marcadores plastidiais e nucleares foram usados para estimar redes de haplotipos-ribotipos e inferir as relações filogenéticas e filogeográficas entre os citotipos. Foi encontrada uma variabilidade muito maior de ribotipos e haplotipos em populações diploides desde o Leste dos Pirenéus ao norte da Itália do que em populações diploides e poliploides de Espanha e Marrocos. Esses resultados mostraram que vários eventos de duplicação de genoma e de diferenciação ocorreram ao longo da área de distribuição. Em conclusão, a sobreposição geográfica e a elevada diversidade citogenética sugerem múltiplas origens dos poliploides. As exigências ecológicas desempenharam um papel na distribuição em mosaico de citotipos e os resultados fornecem dados sólidos para futuras experiências recíprocas. Não há evidência de quebra do sistema de incompatibilidade, mas o fluxo de pólen entre citotipos parece ser possível. Apesar da impossibilidade de desvendar a origem dos poliploides, a diversidade observada fornece dados valiosos para futuros estudos de filogenia e filogeografia e deve ser considerada no estudo da biossistemática desse complexo.