Ras-mediated fibroblast proliferation and lung fibrosis associated with epigenetic modifications provoke spontaneous lung adenocarcinoma

Abstract

Epidemiological studies indicate that idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) significantly increases the risk of development of lung adenocarcinoma (ADC). IPF is the most severe form of interstitial lung disease, characterized by progressive fibrosis, with a median survival of 3-5 years after diagnosis, worsening in those IPF patients developing lung cancer. IPF starts within the lung alveoli and involves the formation of fibrotic foci characterized by a large cellular density of alpha-smooth muscle actin (ACTA2+) fibroblasts, known as myofibroblasts. In IPF patients, lung cancer usually develops in the peripheral area of the lungs, characterized by honeycomb lesions, or in between fibrotic and non-fibrotic areas, being Non- Small Cell Lung Cancer (NSCLC) the most frequent associated form of cancer, particularly the adenocarcinoma sub-type. Aiming at clarify the relationship between αSMA expression and stage of fibrosis and/or cancer, the spatial distribution of myofibroblasts in human-derived interstitial lung diseases (ILDs) and NSCLC biopsies was evaluated. A more conserved spatial distribution of peripheral αSMA+ myofibroblasts distributed within forming fibrotic foci in IPF patients was evidenced, relative to hypersensitivity pneumonitis (HP), besides an increased αSMA expression in myofibroblasts from cancer patient-derived samples. In a parallel study, the analysis of different liquid biopsies (bronchoalveolar lavage and PBMCs) from the same patients with different forms of ILDs (IPF, HP and sarcoidosis), and relying on a set of surface markers for mesenchymal stem cells, fibrocytes, monocytes and lymphocytes cell populations, revealed differences in the density of cell populations and cell differentiation potential, as a function of the corresponding disorder. These are preliminary results that could pave the way to define unique cellular signatures typical of distinct ILDs, aiming at improving patient diagnosis. A major barrier to better understand the molecular and cellular mechanisms of IPF-LC relates with the lack of animal models that connect fibrosis with emergence of epithelial cancers. In organ fibrosis and cancer progression, the chronic injury provokes repetitive wound healing response and irreversible activation of fibroblasts, which is also caused by deregulated epigenetic mechanisms. RASAL gene hypermethylation has been extensively reported in fibroblasts associated with different fibrotic disorders and cancer. The transduced protein is a GTPaseactivating protein 1 (GAP1) that inactivates RAS. It has been denoted that RAS protein can be constitutively activated not only upon occurrence of canonical mutations, but also following RASAL1 hypermethylation. Herein, it was hypothesized that fibrosis provokes RASAL1 hypermethylation, along with loss of stromal RASAL1 expression, leading to RAS overexpression and irreversible activation of αSMA+ lung myofibroblasts with progression to lung adenocarcinoma. To address this hypothesis, the status of RASAL1 promoter methylation was initially characterized in lung fibroblast cell lines established from human IPF and NSCLC biopsies. Epigenetic hypermethylation of the RASAL1 promoter, relative to non-fibrotic/tumorigenic fibroblasts cells, was actually observed. Aiming at characterizing the effect of Rasal1 hypermethylation and Ras activation in αSMA+ lung myofibroblasts, two genetic mouse models based on Rasal1 knockdown or KrasG12D expression were developed, respectively, under the control of the αSMA+ promoter expression. In the former model, and upon intratracheal administration of bleomycin (BLM) to accelerate the induction of lung fibrosis, formation of fibrotic foci (FF), proSP-C+/TTF1+ lung cancer nodules and resistance to fibrosis resolution overtime was observed. Moreover, the generated murine model provides a tool to recapitulate and study human lung features of IPF-LC patients, underlining the relevance of epigenetic mechanisms in sustaining lung fibrosis progression with subsequent cancer development. Given the strong implication of Rasal1 KO in provoking lung ADC, it was then tested a direct way to induce Ras overexpression in αSMA+ lung myofibroblasts, upon generating mice expressing KrasG12D driven by the αSMA promoter (SKY mice). The SKY mouse model provoked higher level of Ras expression, compared to the one upon Rasal1 knockdown, enabling spontaneous remodeling of extracellular matrix (ECM), and transformation of normal lung parenchyma into adenoma and adenocarcinoma progression, upon activating Hgf/cMet signaling, without bleomycin injury. Importantly, increased Ccl2 expression was denoted in both models and recognized as a lung fibroblasts-secreted chemokine involved in sustaining lung fibrosis. Collectively, this study provides new insights on the progression of lung cancer driven by Rasactivated myofibroblasts in the context of IPF-LC patients, enabling the possibility to develop a novel therapeutic targeted strategy.

Estudos epidemiológicos indicam que a fibrose pulmonar idiopática (FPI) aumenta de forma significativa o risco de desenvolvimento de cancro de pulmão de não-pequenas células (NSCLC) é a forma mais frequente de cancro, particularmente o subtipo adenocarcinoma. A FPI inicia-se nos alvéolos pulmonares e envolve a formação de focos fibróticos caracterizados por uma grande densidade de fibroblastos sobre-expressando “alfa-actina do músculo liso”, αSMA (ACTA2+), conhecidos como miofibroblastos. Com o objetivo de esclarecer a relação entre a expressão de αSMA e o estadio de fibrose e/ou cancro, foi avaliada a distribuição espacial dos miofibroblastos em doenças pulmonares intersticiais de origem humana (DPIs) e biópsias de NSCLC. Foi evidenciada uma distribuição espacial mais conservada de miofibroblastos periféricos αSMA+, distribuídos em focos fibróticos em formação em doentes com FPI, relativamente as amostras de pneumonite por hipersensibilidade (HP). A expressão aumentada de αSMA em miofibroblastos de amostras de cancro do pulmão foi igualmente observada. Num estudo paralelo, a análise de biópsias líquidas distintas (lavado bronco-alveolar e PBMCs) dos mesmos doentes com diferentes formas de DPI (de IPF, HP e sarcoidose), e por recurso a marcadores de superfície para células-tronco mesenquimais, populações de células de fibrócitos, monócitos e linfócitos, permitiu a identificação de diferenças ao nível da densidade daquelas populações celulares, bem como do seu potencial de diferenciação, em função das doenças avaliadas. Este tipo de análise, ainda preliminar, poderá melhorar o diagnóstico destes doentes. Uma barreira importante para melhor compreender os mecanismos moleculares e celulares do IPF-LC está relacionada com a falta de modelos animais que associem a fibrose com o surgimento de tumores epiteliais. Na fibrose de órgãos e progressão de cancro, a lesão crónica provoca uma resposta de cicatrização repetitiva e ativação irreversível de fibroblastos, associada a desregulação de mecanismos epigenéticos. O gene RASAL foi amplamente reportado como hipermetilado em fibroblastos associados a fibrose e cancro. A proteína transduzida é uma proteína 1 ativadora de GTPase (GAP1) que inativa o RAS. Foi denotado que a proteína RAS pode ser ativada constitutivamente não apenas na ocorrência de mutações canónicas, mas também após hipermetilação de RASAL1. Neste contexto, foi estabelecido como hipótese que a fibrose provoca hipermetilação de RASAL1, juntamente com a sua perda de expressão, levando à sobre-expressão de RAS e ativação irreversível de miofibroblastos pulmonares αSMA+, com progressão para adenocarcinoma pulmonar. Para abordar esta hipótese, o estado da metilação do promotor RASAL1 foi inicialmente caracterizado em linhas de celulares de fibroblastos pulmonares estabelecidas a partir de biópsias de IPF e NSCLC humanas. Estes estudos revelaram a hipermetilação epigenética do promotor RASAL1, relativamente as células de fibroblastos não fibróticos/tumorigénicos. Para caracterizar o efeito da hipermetilação de Rasal1 e ativação de Ras em miofibroblastos de pulmão αSMA+, foram desenvolvidos dois modelos animais baseados na deleção de Rasal1 ou na sobre-expressão de KrasG12D, respectivamente, sob o controle de expressão do promotor αSMA+. No primeiro modelo, acompanhado de administração de bleomicina (BLM) para acelerar a indução de fibrose pulmonar, foi identificada a formação de focos fibróticos, nódulos de cancro de pulmão proSP-C+/TTF1+ e resistência à resolução de fibrose. Este modelo é uma ferramenta importante para recapitular e estudar as características do pulmão humano de doentes com IPFLC, destacando a relevância dos mecanismos epigenéticos na sustentação da progressão da fibrose pulmonar com o consequente desenvolvimento de cancro. Dada a relevância da deleção de Rasal1 no desenvolvimento de ADC pulmonar, foi então testada uma maneira direta de induzir a sobre-expressão de Ras em miofibroblastos pulmonares αSMA+, mediante o desenvolvimento de modelo animal com expressão da mutação KrasG12D, induzido pelo promotor αSMA (modelo animal SKY). Este modelo caracteriza-se por sobre-expressão de Ras, numa extensão superior à observada no modelo com deleção de Rasal1, reorganização espontânea da matriz extracelular (ECM), e subsequente transformação do parênquima pulmonar normal em adenoma e progressão de adenocarcinoma, mediante ativação da via de sinalização Hgf/cMet, sem administração de bleomicina. O aumento da expressão de Ccl2 foi denotado em ambos os modelos animais e reconhecido como uma quimiocina secretada por fibroblastos de pulmão, envolvida na sustentação da fibrose pulmonar. Em suma, este estudo proporciona novas indicações sobre a progressão do cancro de pulmão mediada por miofibroblastos ativados por Ras, no contexto de doentes com FPI-LC, bem como novas perspetivas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas.