Fluorescent Proteins Encapsulation in Silica Aerogels

Abstract

Fluorescent materials are conventionally derived from phosphors of rare elements, raising concerns due to the scarcity of these resources. The use of fluorescent dyes and quantum dots remains limited due to limitations surrounding their toxicity. In contrast, Fluorescent proteins offer a biodegradable, sustainable, and biocompatible alternative, if successfully integrated into a solid dry matrix. Furthermore, their incorporation into a solid matrix could enhance their stability, which tends to be restricted when in solution at room temperature. Currently, there is a vast library of Fluorescent proteins with a wide range of colors and properties, and whose most significant applications have been in the biological field. The most studied Fluorescent Protein is the Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP). Consequently, acknowledging the importance and potential of Fluorescent proteins for the creation of novel fluorescent solid materials and the improvements that their incorporation into a solid matrix could bring to their stability, this study aimed to produce, purify, and characterize Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), and subsequently encapsulate it within silica aerogels, via the sol-gel technology.EGFP production was achieved through the cultivation of E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] with Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. After cell lysis, EGFP was recovered in raw extracts, which were subjected to purification using aqueous biphasic systems composed of polypropylene glycol (PPG-400) and choline chloride ([Ch]Cl). The absorbance and fluorescence spectra of both the raw and purified extracts exhibited two distinct peaks at λexc 278 nm/λem 509 nm and λexc 488 nm/λem 509 nm. Quantum yield and fluorescence lifetime values were 0.82 and 2.70 ns for the raw extracts, and 0.79 and 2.67 ns for the purified extract.The incorporation of EGFP raw extracts in the gels was done prior to gelation, using various precursor combinations (tetraethyl orthosilicate (TEOS) alone, TEOS with (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GLYMO), and TEOS with (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)) and employing two different solvents (heptane or ethanol) during solvent exchange steps. Different surface modification agents (Hexamethyldisilazane and Dimethoxydimethylsilane) were also tested. Among the approaches tested, the combination of TEOS and GLYMO with solvent exchanges in heptane exhibited the most promising results, retaining green fluorescence without significant visual changes, until the silylation step, where the fluorescence would shift towards a lighter and more whitish hue. The quantum yield of aerogels made from these precursors revealed a significant decrease after silylation had occurred. The drying step also revealed to be a critical step to the fluorescence maintenance, with samples made from TEOS and GLYMO, without surface modification, losing their green fluorescence after lyophilization. Further analysis, including Fourier transform infrared spectroscopy with an attenuated total reflectance (ATR-FTIR), elemental analysis, and thermogravimetric analysis, suggested that EGFP could be encapsulated within the gel matrix but underwent significant modifications, resulting in fluorescence modification. While the dried aerogels no longer exhibited the distinctive green fluorescence associated with EGFP, it is important to note that EGFP was effectively encapsulated within wet silica gels before the silylation and drying processes, retaining its conformation within the silica matrix.

Materiais fluorescentes são convencionalmente derivados de elementos raros, o que levanta preocupações devido à escassez desses recursos. A utilização de tintas fluorescentes e quantum dots permanece limitada devido à sua toxicidade. Contrariamente, Proteínas fluorescentes oferecem uma alternativa biodegradável, sustentável e biocompatível. Se integradas com sucesso numa matriz sólida e seca, poderão superar as limitações mencionadas. Além disso, a sua incorporação numa matriz sólida poderia melhorar a estabilidade, que geralmente é limitada quando em solução à temperatura ambiente.Hoje existe uma vasta biblioteca de Proteínas fluorescentes com uma ampla gama de cores e propriedades, cujas aplicações mais significativas têm sido no campo da biologia. A Proteína fluorescente mais estudada é a Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP). Assim, reconhecendo a importância e o potencial destas biomoléculas na criação de novos materiais fluorescentes, assim como potenciais melhorias que a incorporação em matrizes sólidas poderia trazer à sua estabilidade, este estudo visou produzir, purificar e caracterizar EGFP e posteriormente encapsulá-la em aerogéis de sílica, através da tecnologia sol-gel.A produção da EGFP foi alcançada por meio do cultivo de E. coli BL21 (DE3) [pLysS; pET28(a)] com indução de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Após a lise celular, a EGFP foi recuperada em extratos brutos, que foram submetidos a purificação usando sistemas aquosos bifásicos compostos por polipropilenoglicol (PPG-400) e cloreto de colina ([Ch]Cl). Os espectros de absorvência e fluorescência dos extratos brutos e purificados apresentaram dois picos distintos em λexc 278 nm/λem 509 nm e λexc 488 nm/λem 509 nm. Os valores de rendimento quântico e tempo de vida da fluorescência foram de 0.82 e 2.70 ns para os extratos brutos e 0.79 e 2.67 ns para o extrato purificado.A incorporação dos extratos brutos de EGFP nos aerogéis foi realizada antes da gelificação, utilizando várias combinações de precursores (tetraetilortosilicato (TEOS) isoladamente, TEOS com (3-Glicidoxipropil)trimetoxisilano (GLYMO) e TEOS com (3-Aminopropil)triethoxisilano (APTES)) e dois solventes diferentes (heptano ou etanol) durante as trocas de solvente. Diferentes agentes de modificação de superfície (Hexametildisilazano ou Dimetoxi-dimetilsilano) também foram testados. Entre as abordagens testadas, a combinação de TEOS e GLYMO com trocas de solvente em heptano apresentou os resultados mais promissores, mantendo a fluorescência verde sem alterações visuais significativas, até a etapa de sililação, onde a fluorescência passava a ter uma tonalidade mais clara e esbranquiçada. O rendimento quântico dos aerogéis feitos com esses precursores revelou uma diminuição significativa após a sililação. A secagem também se mostrou crítica para a manutenção da fluorescência, com amostras feitas com TEOS e GLYMO, sem modificação de superfície, a perderem a fluorescência verde após a liofilização. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (ATR-FTIR), análise elemental e a análise termo gravimétrica, indicaram que a EGFP poderia ser encapsulada na matriz do gel, mas passava por modificações significativas, resultando em mudanças da fluorescência.Embora os aerogéis de sílica secos tenham perdido a fluorescência verde característica da EGFP, é importante notar que esta foi efetivamente encapsulada em géis de sílica não submetidos a sililação e secagem, mantendo a sua conformação na matriz de sílica.