Gene therapy mediated by glycopolymers-based nanocarriers in combination with chemotherapeutic drugs as a potential therapeutic strategy for hepatocellular carcinoma

Abstract

O carcinoma hepatocelular (CHC) corresponde a cerca de 75-85% dos tumores primários hepáticos e é a neoplasia com a terceira maior taxa de mortalidade no mundo. Ao longo dos últimos anos foram aprovados diversos inibidores de tirosinas cinases e checkpoint imunológicos para o tratamento de doentes com CHC em estádio avançado. No entanto, devido à reduzida taxa de resposta, à elevada toxicidade, à resistência aos fármacos e à, subsequente, recidiva do tumor, o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais é absolutamente fundamental.Nesse contexto, a terapia génica tornou-se uma ferramenta terapêutica promissora para o tratamento do cancro. No entanto, para alcançar os efeitos terapêuticos desejados e minimizar os efeitos secundários, é crucial desenvolver sistemas de transporte e entrega de material genético eficientes e específicos para as células alvo. Os nanossistemas com base em glicopolímeros têm-se destacado devido à sua inerente biocompatibilidade, estabilidade coloidal e alta afinidade de ligação ao recetor das asialoglicoproteínas (ASGPR), um recetor amplamente expresso na superfície das células de CHC. No entanto, o processo de síntese dos glícopolímeros, devido a problemas de solubilização e à necessidade de várias etapas de proteção/desproteção, é bastante trabalhoso e complexo. Neste projeto, foram desenvolvidos nanossistemas de base glicopolimérica para mediar duas estratégias de terapia génica distintas, as quais foram combinadas com baixas concentrações de agentes quimioterapêuticos, de modo a promover um efeito antitumoral mais acentuado e reduzir potenciais efeitos secundários.A primeira parte deste trabalho foi focada no desenvolvimento de um nanossistema de entrega de genes altamente eficiente e específico para CHC, de modo a inibir a expressão do oncogene c-MYC e a sensibilizar as células tumorais ao sorafenib (SF). Foi desenvolvida uma biblioteca de glicopolímeros catiónicos, à base do poli-2-aminoetil metacrilato (PAMA) e poli-2-lactobionamidoetil metacrilato (PLAMA), com diferentes composições, estruturas (bloco ou aleatória) e rácios de monómero carbohidrato/catiónico, sintetizados através da técnica de polimerização radicalar por transferência de átomo com ativadores regenerados por transferência de eletrões (ARGET ATRP). Os nanossistemas preparados com o glicopolímero com estrutura aleatória PAMA114-co-PLAMA20 foram os que demonstraram maior eficiência para a entrega de material genético. Estes nanossistemas exibiram uma relação de atividade de transfecção/citotoxicidade muito melhor do que os nanossistemas preparados com os glicopolímeros em bloco correspondentes. Os nanovetores preparados com o glicopolímero PAMA114-co-PLAMA20 ligam-se especificamente ao recetor das asialogliproteínas e são maioritariamente internalizados através da via endocítica de vesículas revestida por clatrina. Os níveis de c-MYC foram significativamente diminuídos pela expressão do short hairpin RNA contra o c-MYC (MYC shRNA), resultando na inibição eficiente da proliferação das células tumorais e em elevados níveis de apoptose em modelos 2D e 3D de CHC. Além disso, o silenciamento de c-MYC aumentou a sensibilidade das células de CHC para o SF (IC50 para MYC shRNA+ SF de 1,9 μM em comparação com 6,9 μM para o controlo shRNA + SF). De um modo geral, os resultados obtidos demonstraram o grande potencial dos nanossistemas PAMA114-co-PLAMA20/MYC shRNA combinados com reduzidas doses de SF para o tratamento do CHC.A segunda parte do trabalho centrou-se no desenvolvimento de um nanossistema para mediar uma estratégia de terapia de gene suicida. Para avaliar o efeito da amina primária nas propriedades físico-químicas, atividade biológica, biocompatibilidade e especificidade dos nanossistemas, uma mini-biblioteca de glicopolímeros à base de polimetacrilato de amina primária, com grau de polimerização fixo (DP) do LAMA e diferentes valores de DP para o AMA, foi sintetizada por ARGET ATRP. Os glicoplexos gerados demonstraram elevada especificidade para o recetor ASGPR e propriedades físico-químicas adequadas, especialmente em termos de tamanho e carga de superfície, o que permitiu a sua internalização através da endocitose mediada por clatrina. Adicionalmente, a estratégia de terapia de gene suicida herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir (HSV-Tk/GCV), mediada pelos nanossistemas preparados com o glicopolímero PAMA144-co-PLAMA19, resultou numa elevada atividade antitumoral em modelos 2D e 3D de cultura celular de CHC, que foi significativamente incrementada pela combinação com pequenas quantidades de docetaxel.Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese demonstraram o potencial dos glicopolímeros com base em polimetacrilato de amina primária como nanossistemas de transporte e entrega de material genético direcionados ao CHC e destacam a importância das estratégias antitumorais combinadas para o tratamento desta neoplasia.

Hepatocellular carcinoma (HCC) accounts for approximately 75–85% of primary liver cancers and is the third leading cause of cancer-related deaths worldwide. In recent years, multiple kinase and immune checkpoint inhibitors have been approved as treatment options for patients with advanced-stage HCC. However, due to the low response rate, drug toxicity, resistance and subsequent tumor relapse, the development of novel strategies against HCC is urgently needed. In this context, gene therapy has become a promising therapeutic tool for cancer treatment. However, to achieve the desired therapeutic effects and minimize off-target effects, the development of an efficient and targeted gene delivery platform is crucial. In this context, glycopolymers-based nanocarriers have attracted considerable attention due to their biocompatibility, colloidal stability and high binding affinity to the asialoglycoprotein receptor (ASGPR), an overexpressed receptor in HCC cells. However, their synthesis remains laborious and complex, with problems in solubilization and the need for protection/deprotection steps.In this project, nanocarriers based on glycopolymers were developed to mediate two distinct gene therapy strategies, in combination with low concentrations of chemotherapeutic agents, to promote a higher anti-HCC effect and reduce potential side-effects.The first part of this work was focused on the development of a highly efficient and HCC-specific gene delivery nanosystem that downregulates c-MYC expression and sensitizes tumor cells to low concentrations of sorafenib (SF). To this end, a library of tailor-made cationic glycopolymers, based on poly(2-aminoethyl methacrylate hydrochloride) (PAMA) and poly(2-lactobionamidoethyl methacrylate) (PLAMA), with different compositions, structures (block or random) and carbohydrate/cationic ratios, was synthesized by activators regenerated by electron transfer atom transfer radical polymerization (ARGET-ATRP). Nanocarriers prepared with the random glycopolymer PAMA114-co-PLAMA20 were the most efficient for gene delivery. Moreover, these nanosystems exhibited a much better transfection activity/cytotoxicity ratio than the corresponding nanocarriers based on block glycopolymers. PAMA114-co-PLAMA20-based nanosystems specifically bound to the ASGPR and were internalized by the clathrin-coated pit endocytic pathway. The c-MYC levels were significantly downregulated by c-MYC short-hairpin RNA (MYC shRNA), resulting in efficient inhibition of tumor cell proliferation and high levels of apoptosis in 2D and 3D HCC-tumor models. Moreover, c-MYC silencing increased the sensitivity of HCC cells to SF (IC50 for MYC shRNA + SF 1.9 μM compared with 6.9 μM for control shRNA + SF). Overall, the data obtained demonstrate the great potential of PAMA114-co-PLAMA20/MYC shRNA nanosystems combined with low doses of SF for the treatment of HCC.The second part of the work focused in the development of a nanocarrier to mediate a suicide gene therapy strategy. To evaluate the effect of primary amine content on the physicochemical properties, biological activity, biocompatibility and ASGPR specificity of nanocarriers, a mini-library of well-defined glycopolymers based on primary amines and polymethacrylates, with a fixed degree of polymerization (DP) of LAMA and different values of DP of AMA, was synthesized by ARGET ATRP. The glycoplexes generated showed high specificity for ASGPR and possessed suitable physicochemical properties, particularly in terms of size and surface charge, which allowed their internalization via the clathrin-coated pit endocytic pathway. Moreover, the herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir (HSV-Tk/GCV) suicide gene therapy strategy, mediated by PAMA144-co-PLAMA19-based nanocarriers, resulted in high antitumor activity in 2D and 3D cell culture models of HCC, which was significantly enhanced when combined with small amounts of docetaxel. Overall, the results presents in this thesis demonstrated the potential of primary-amine polymethacrylate-containing-glycopolymers as HCC-targeted gene delivery nanosystems and highlight the importance of the combined antitumor strategies for the treatment of this disease.