Biology and ecology of the root-knot nematode Meloidogyne hispanica : a species of emerging importance

Abstract

Meloidogyne hispanica Hirschmann, 1986 was originally detected in Spain causing important losses to Prunus spp. Since then, the presence of this species has been reported associated to other economically important crops worldwide (Africa, Asia, Australia, Europe, and North, Central, and South America). An accurate and reliable identification of this species is needed for research purposes and also for devising an effective, sustainable and environmentally-safe control strategy. The main goals of this study were to characterize morpho-biometrically, biochemically and molecularly Portuguese M. hispanica isolates and to understand better its biology and ecology. The developed work included the assessment of the impacts of temperature on its life cycle; evaluation of host resistance to M. hispanica in several cultivated plants and tomato genotypes with the Mi-1.2 gene, and determination of the effects of the inoculum level on nematode reproduction and growth on various tomato genotypes. A morphobiometrical study was carried out on males, females and juveniles of seven M. hispanica isolates and, although, the characters were similar to the original description of the species, the differentiation of M. hispanica from other Meloidogyne species, mainly M. arenaria and M. incognita can be very difficult. Reproducible and similar SDS-PAGE protein patterns were found for M. hispanica isolates and M. arenaria, M. ethiopica, M. hapla, M. incognita, M. javanica and M. mayaguensis; only M. chitwoodi and M. megadora revealed distinct profiles. Biochemical and molecular techniques provided a more accurate identification and differentiation of M. hispanica, this was achieved by esterase phenotype (Hi4), and mtDNA-PCR-RFLP analysis of the region between COII and 16S rRNA genes, with primers C2F3/MRH106. Variability in mtDNA sequences allowed the discrimination of M. hispanica (ca. 1,800 bp) from M. hapla (ca. 650 bp), M. chitwoodi (ca. 650 bp), M. mayaguensis (ca. 850 bp) and M. arenaria (ca. 1,300 bp) and the species (M. ethiopica, M. javanica and M. incognita) with similar amplified products by HinfI and DraIII. Two digestion fragments (ca. 1,700 and 100 bp) were obtained for HinfI and no digestion occurred with DraIII to M. hispanica. However, more M. hispanica isolates need to be tested in order to strengthen the results obtained and to validate the potential applicability of this methodology for diagnosis of this species of root-knot nematode. The life cycle of M. hispanica in the tomato cultivars Easypeel highly susceptible, and Rossol, with the root-knot nematode (RKN) resistance Mi-1.2 gene, was studied over the temperature range of 10 to 35ºC. A linear relationship between temperature and the rate of embryogenesis and life cycle was obtained from 15 to 30ºC and 20 to 30ºC, respectively. Meloidogyne hispanica embryogenesis was faster at 25 and 30ºC and no development occurred at 10 or 35ºC. At temperatures below 35ºC, several secondstage juveniles (J2) failed to establish and develop in roots of tomato cv. Rossol, with the proportion of adult females recorded on roots significantly lower than on cv. Easypeel, and no reproduction occurred at 15 and 25ºC. At 30 and 35ºC, the development was similar on both tomato cultivars. The life cycle in the cv. Easypeel was shorter at 25 and 30ºC, and at 15ºC, the presence of eggs was not observed until 80 days after inoculation. Our results suggest that M. hispanica is most suited to soil temperatures around 25ºC. The estimated base temperatures were 11.49ºC and 10.22ºC and thermal constant 76.92 and 515.46 DD for embryogenesis and life cycle completion, respectively. Predicted climate changes indicate that M. hispanica could spread in Southern Europe and move north. Sixty three cultivars, including 18 plant species from Alliaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Poaceae and Solanaceae, were assessed for host suitability to M. hispanica on the basis of root gall index (GI) and reproduction factor (Rf). All cultivars were susceptible (GI = 3-5; Rf = 1.15-262.86), except cultivar Bacalan of cabbage, Temporão of cauliflower and pepper Zafiro R2 classified as hypersusceptible (GI > 2.4; Rf < 0.47); and cultivars Aurelio and Solero of pepper as resistant (GI < 0.4; Rf < 0.03). The reproduction of M. hispanica on the three pepper cultivars was evaluated using two inoculum levels (2,500 and 5,000 eggs) at four temperatures (24.4±8.2ºC, 25.0±2.7ºC, 29.3±1.8ºC and 33.6±1.2ºC), and these cultivars were considered resistant hosts (GI < 1.8; Rf < 0.4) at all conditions. In the cv. Aurelio, at 33.6±1.2ºC, a limited number of J2 developed into females that produced eggs. The eggs from these virulent females were inoculated, by two successive transfers into cv. Aurelio of pepper, in order to bulk up this virulent isolate. This new isolate was able to reproduce on all three pepper cultivars breaking the resistance. Our results suggest that the initial M. hispanica isolate is a mixture of virulent and avirulent individuals. These pepper cultivars can be used as an alternative to the chemical control, but should be used in an integrated management context in combination with other control measures to prevent the selection of virulent lines. Twenty five tomato genotypes were screened for the RKN resistance Mi-1.2 gene, by amplification of markers REX-1 and Mi23 as sequence-characterised amplified regions. Ten heterozygous tomato genotypes (Mimi), eight homozygous (MiMi) at the Mi locus and six (mimi) lacking the Mi-1.2 gene for resistance to RKN were identified. Only tomato genotype Valouro RZ F1 was homozygous (MiMi) and heterozygous (Mimi) at the Mi locus when using the REX-1 and Mi23 markers, respectively. The results of the host suitability suggest a possible dosage effect of the Mi-1.2 gene and an influence of the genetic background of the plants containing the Mi-1.2 gene on final population density of M. hispanica. The increasing number of Mi-1.2 alleles (0, 1 or 2) is associated with the decrease of the final population density. Ten tomato genotypes, with Mi-1.2 gene, out the 25 genotypes are commercially available, but only Rapit (Mimi; IG = 4, Rf = 0.62) can be used to inhibit the increase of M. hispanica populations in the soil and to control the three most common Meloidogyne species (M. arenaria, M. incognita and M. javanica). Effects of three inoculum levels (2,500, 5,000 and 10,000 eggs/plant) on the reproduction of M. hispanica and M. javanica isolates and growth of the tomato genotypes Easypeel and Moneymaker (used to maintain the RKN isolates on the laboratory), and Motelle and VFNT-Cherr (with the Mi-1.2 gene) were evaluated 60 days after inoculation at 25±2ºC. The host status was based on GI and Rf, and shoot/root length and fresh/dry root and shoot weight were also recorded. All tomato plants revealed a trend to show lower values of growth parameters due to the damage caused by the increasing number of nematodes that invaded the roots. However, the genotypes Motelle and VFNT-Cherr remained unchanged regarding shoot and total shoot plus root dry weight. The two RKN species were identified as naturally virulent to tomato plants with the Mi-1.2 gene, but M. javanica showed a higher reproductive and destructive potential than M. hispanica. Tomato plants inoculated with M. hispanica presented the higher values for growth parameters when compared with plants inoculated with M. javanica. Meloidogyne hispanica can be considered a polyphagous species of emerging importance with potential economic impact to agricultural areas. These results show that further research should be done to advance the knowledge on new sources of resistance and the identification of plant species and/or cultivars resistant to M. hispanica. To improve the management of M. hispanica the pathogenicity of the local populations should be assessed before a decision is made on the crop rotation scheme to be used and it is also important to develop preventive measures to avoid the dispersion of this species.

Meloidogyne hispanica Hirschmann, 1986 foi detectada pela primeira vez em Espanha causando perdas importantes em Prunus spp. Desde então, esta espécie tem vindo a ser detectada em vários continentes (África, Ásia, Austrália, Europa, e no Norte, Centro e Sul da América) associada a outras culturas economicamente importantes. A identificação correcta desta espécie de nemátodes-das-galhas radiculares (NGR) é fundamental não só para fins de investigação mas também para a concepção de uma estratégia de controlo efectiva, sustentável e amiga do ambiente. Os objectivos principais deste trabalho foram caracterizar morfo-biometrica, bioquímica e molecularmente isolados Portugueses de M. hispanica e compreender melhor a sua biologia e ecologia. Os estudos realizados incluíram a avaliação dos impactos da temperatura no seu ciclo de vida, determinação da patogenicidade de M. hispanica em plantas cultivadas e genótipos de tomateiro com o gene Mi-1.2, e determinação dos efeitos do nível de inóculo na reprodução do nemátode e crescimento de vários genótipos de tomateiro. Os resultados obtidos nos estudos morfobiométricos dos machos, fêmeas e jovens do segundo estádio juvenil (J2) de sete isolados de M. hispanica estão de acordo com a descrição original da espécie. Contudo, a diferenciação de M. hispanica de outras espécies de Meloidogyne, principalmente M. arenaria e M. incognita, pode ser muito difícil. Os perfis proteicos de M. hispanica, obtidos por SDS-PAGE, foram reproduzíveis e semelhantes aos de M. arenaria, M. ethiopica, M. hapla, M. incognita, M. javanica e M. mayaguensis; apenas M. chitwoodi e M. megadora apresentaram perfis proteicos distintos. A utilização de técnicas bioquímicas e moleculares permitiu uma identificação e diferenciação mais precisa de M. hispanica, especificamente através da análise dos fenótipos de esterases (Hi4) e da análise por PCR-RFLP da região entre os genes COII e 16S rRNA do ADN mitocondrial (ADNmt), com os primers C2F3 e MRH106. A variabilidade encontrada nas sequências de ADNmt permitiu diferenciar M. hispanica (ca. 1800 bp) das espécies M. hapla (ca. 650 bp), M. chitwoodi (ca. 650 bp), M. mayaguensis (ca. 850 bp) e M. arenaria (ca. 1300 bp) e das espécies (M. ethiopica, M. javanica and M. incognita) com produtos de amplificação semelhantes pelos padrões de restrição obtidos com as endonucleases HinfI e DraIII. Em M. hispanica foram obtidos dois fragmentos (ca. 1700 e 100 bp) com a enzima de restrição HinfI, não tendo ocorrido digestão dos produtos amplificados com a enzima DraIII. No entanto, um maior número de isolados de M. hispanica deverá ser testado a fim de validar os resultados obtidos e a aplicabilidade desta metodologia no diagnóstico desta espécie de NGR. O ciclo de vida de M. hispanica foi estudado, num intervalo de temperaturas entre 10- 35ºC, em cultivares de tomateiro Easypeel, susceptível a NGR, e Rossol, com o gene Mi-1.2 que confere resistência a NGR, tendo sido obtida uma relação linear entre a temperatura e a taxa de desenvolvimento embrionário e o ciclo de vida entre 15-30ºC e 20-30ºC, respectivamente. O desenvolvimento embrionário de M. hispanica foi mais rápido a 25 e 30ºC, enquanto a 10 e 35ºC não ocorreu desenvolvimento. Nas raízes de tomateiro cv. Rossol, a temperaturas inferiores a 35ºC, alguns J2 foram incapazes de se estabelecer e desenvolver, tendo-se registado uma proporção de fêmeas significativamente menor quando comparada com a cultivar Easypeel; a 15 e 25ºC não houve reprodução. O desenvolvimento foi semelhante em ambas as cultivares de tomateiro a 30 e 35ºC. Na cultivar Easypeel de tomateiro, o ciclo de vida foi mais curto a 25 e 30ºC, e a 15ºC não se observou a presença de ovos até aos 80 dias após a inoculação. Os resultados obtidos sugerem que esta espécie se encontra adaptada a temperaturas do solo à volta de 25ºC. Os valores estimados para a temperatura basal foram 11,49ºC e 10,22ºC e os valores da constante térmica para o desenvolvimento embrionário e ciclo de vida foram 76,92 e 515,46 DD, respectivamente. Considerando as alterações climáticas previstas, M. hispanica, tal como as espécies tropicais de NGR, poderá disseminar-se pelo Sul da Europa e mover-se para Norte. O grau de resistência de 63 cultivares, de 18 espécies de plantas das famílias Alliaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Poaceae e Solanaceae, a M. hispanica foi avaliado com base no índice de galhas (IG) e no factor de reprodução (Rf). Todas as cultivares foram consideradas susceptíveis (IG = 3-5; Rf = 1,15-262,86), excepto as cultivares Bacalan de couve, Temporão de couve-flor e Zafiro R2 de pimento classificadas como hipersusceptíveis (IG > 2,4; Rf < 0,47); e as cultivars Aurelio e Solero de pimento como resistentes (IG < 0,4; Rf < 0,03) ao nemátode. Em seguida, foi avaliada a reprodução de M. hispanica nas três cultivares de pimento utilizando dois níveis de inóculo (2500 e 5000 ovos) a quatro temperaturas (24,4±8,2ºC, 25,0±2,7ºC, 29,3±1,8ºC e 33,6±1,2ºC). Novamente, estas cultivares de pimento foram consideradas resistentes a M. hispanica (IG < 1,8; Rf < 0,4) em todas as condições testadas. No entanto, na cv. Aurelio, a 33,6±1,2ºC, alguns J2 desenvolveram-se até ao estádio de fêmea adulta que produziram ovos. Os ovos destas fêmeas virulentas foram inoculados em pimento cv. Aurelio para aumentar a densidade populacional deste isolado virulento. Este novo isolado reproduziu-se nas três cultivares de pimento quebrando a resistência. Os resultados sugerem que o isolado original de M. hispanica é uma mistura de indivíduos virulentos e avirulentos. Estas cultivares de pimento podem ser consideradas uma alternativa ao uso de nematodicidas, devendo ser utilizadas com outras medidas de controlo, para evitar a selecção de linhas virulentas. A presença/ausência do gene Mi-1.2, responsável pela resistência a NGR, foi verificada em vinte e cinco genótipos de tomateiro através da amplificação dos marcadores REX-1 e Mi23. Dez genótipos de tomateiro foram identificados como heterozigóticos (Mimi) e oito homozigóticos (MiMi) para o locus Mi e seis (mimi) não apresentavam o gene Mi-1.2. Apenas o genótipo Valouro RZ F1 foi considerado homozigótico (MiMi) ou heterozigótico (Mimi) dependendo do marcador utilizado, REX-1 ou Mi23, respectivamente. Os resultados obtidos nos ensaios de patogenicidade sugerem um possível efeito doseador do gene Mi-1.2, bem como uma influência do fundo genético, das plantas que contêm o gene de resistência, na densidade populacional final de M. hispanica. O número crescente de alelos do gene Mi-1.2 (0, 1 ou 2) está associado a uma diminuição da densidade populacional final do nemátode. Dez genótipos de tomateiro com o gene Mi-1.2, dos 25 avaliados, estão disponíveis comercialmente, mas apenas o tomateiro Rapit (Mimi; IG = 4, Rf = 0,62) pode ser utilizado para impedir o aumento das populações de M. hispanica no solo e controlar as populações das três espécies mais comuns de Meloidogyne (M. arenaria, M. incognita e M. javanica). O efeito de três níveis de inóculo (2500, 5000 and 10 000 ovos/planta) na reprodução de M. hispanica e M. javanica e no desenvolvimento dos tomateiros Easypeel e Moneymaker (usados para manter as populações de NGR em laboratório) e Motelle e VFNT-Cherr (com o gene Mi-1.2) foi avaliado, a 25±2ºC, 60 dias após a inoculação. O grau de resistência foi baseado no IG e Rf, tendo-se ainda avaliado o comprimento da raiz/caule e peso seco/húmido das raízes e do caule. De um modo geral, as plantas apresentaram valores baixos nos parâmetros relacionados com o desenvolvimento, devido aos danos causados pelo aumento do número de nemátodes que invadiram as raízes, com excepção dos genótipos Motelle e VFNT-Cherr que apresentaram valores estáveis de peso seco total e do caule. As duas espécies de NGR foram identificadas como naturalmente virulentas ao gene Mi-1.2, contudo M. javanica apresentou um potencial reprodutivo e destrutivo superior a M. hispanica. Os tomateiros inoculados com M. hispanica apresentaram valores mais elevados para os parâmetros de desenvolvimento das plantas quando comparados com os das plantas inoculadas com M. javanica. Meloidogyne hispanica pode ser considerada uma espécie polífaga de importância emergente com impacto económico em áreas agrícolas. Os resultados obtidos mostram que uma das linhas de investigação a ser promovida deveria estar relacionada com a descoberta de novas fontes de resistência e com a identificação de espécies de plantas e/ou cultivares resistentes a M. hispanica. Para um controlo mais eficiente de M. hispanica é fundamental a avaliação da patogenicidade das populações locais antes da incorporação de plantas em esquemas de rotação de culturas e a implementação de medidas preventivas para evitar a dispersão desta espécie.