Desenvolvimento e aplicações do biossensor electroquímico com DNA

Abstract

O objectivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de um biossensor electroquímico com DNA para monitorização directa dos processos de hibridização e para detecção dos danos oxidativos causados ao DNA por diferentes compostos. Deste modo é necessária uma boa compreensão do comportamento redox dos ácidos nucleicos e dos seus produtos de degradação. A base purínica adenina e o seu produto de oxidação, a 2,8-dihidroxiadenina (2,8-DHA), foram investigadas por métodos voltamétricos. Os resultados obtidos são de grande interesse para a compreensão dos mecanismos redox destas substâncias e para a explicação das propriedades mutagénicas da 2,8-DHA. A oxidação de polinucleotídeos de sequências conhecidas, de DNA de hélice simples e dupla foi investigada em solução. Os polinucleotídeos de bases purínicas são facilmente oxidados enquanto que a oxidação dos polinucleotídeos de bases pirimidínicas ocorre apenas em condições especiais. A imobilização de oligonucleotídeos (ODNs) de sequências conhecidas na superfície do eléctrodo de carbono vítreo (GCE) foi seguida da hibridização com a sequência complementar ou por experiências de controle com ODNs não-complementares. Os dados obtidos mostraram que a adsorção não-específica influencia os resultados electroquímicos. Para reduzir a contribuição dos ODNs não-específicamente adsorvidos foi efectuada a modificação da superfície do GCE com ODNs oxidados. A interacção in situ do flavonóide quercitina com o DNA foi estudada com o objectivo de compreender melhor a sua acção in vivo sobre o DNA. A oxidação da quercitina causa danos oxidativos nos resíduos de guanina do DNA levando à formação de 8-oxoG. Foi proposto um mecanismo para a interacção entre a quercitina e o DNA. Foi investigado o comportamento redox do glivec, tendo sido dada particular atenção à forte adsorção na superfície do GCE do seu produto de oxidação. Foi desenvolvido um método para detecção de glivec em fluidos biológicos. A interacção do glivec com DNA foi investigada utilizando vários tipos de biossensores com DNA. Foi proposto um mecanismo para explicar os danos oxidativos que ocorrem nos resíduos de adenina e levam à formação de 2,8-DHA.

The objective of this project was the development of a DNA electrochemical biosensor for direct monitoring of hybridization processes and for the detection of oxidative damage to DNA. For this purpose a good understanding of the redox behavior of nucleic acids and their degradation products was necessary. The purinic base adenine and its main oxidation product, 2,8-dihydroxyadenine (2,8-DHA), were investigated using different voltammetric methods. The results obtained are of great importance for the understanding of the redox mechanisms undergone by these compounds and can explain the mutagenic properties of 2,8-DHA. The oxidation of polynucleotides of known sequences, and of single-stranded and double-stranded DNA was investigated in solution. Polynucleotides containing purinic bases are easily oxidized whereas the oxidation of pyrimidinic polynucleotides occurs only under special conditions. The immobilization of known oligonucleotide (ODN) sequences onto a glassy carbon electrode (GCE) surface was followed by hybridization with the complementary sequence, and control experiments with non-complementary ODNs. The data obtained showed that non-specific adsorption strongly influenced the results. To reduce the contribution of non-specifically adsorbed ODNs the GCE surface was modified with oxidized ODNs. The in situ interaction of the flavonoid quercetin with DNA was studied in order to explain the in vivo mode of action of quercetin on DNA. Oxidation of quercetin caused damage to guanine residues in DNA leading to the formation of 8-oxoG. A mechanism for the interaction between quercetin and DNA was proposed. The redox behavior of glivec was investigated, special attention being paid to the strong adsorption of its oxidation product at the GCE surface. A method for glivec determination in biological fluids was developed. The interaction between glivec and DNA was studied using different types of DNA biosensors. A mechanism was proposed to explain the fact that oxidative damage occurs mainly at adenine residues that in turn lead to the formation of 2,8-DHA.