Mitochondria and protein homeostasis in Parkinson's disease : from quality control pathways to an integrated network

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative disorder affecting almost 2% of people over 65 years of age. The primary neuropathological hallmark of PD is the degeneration of the nigrostriatal dopaminergic pathway which, by depleting dopamine in the brain, initiates abnormal motor symptoms including resting tremor, bradykinesia, postural instability, gait difficulty and rigidity. A second relevant hallmark is the presence of intracellular inclusion bodies, known as Lewy bodies that mainly contain aggregated α-synuclein. While the etiology involved in the development of PD is unknown, 90-95% of PD cases occurs sporadically and correlates, in part, with mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Furthermore, the identification of single genes associated to the familial forms of PD has revolutionized this field of research, providing unique opportunities to pursue novel mechanisms and clues to the pathogenesis of PD. The sustained study of the cellular functions of each PD-related gene indicates that protein misfolding and aggregation, as well as, dysfunction of their quality control systems may play a crucial role in the cascade of deleterious events implicated in the neurodegenerative process of PD. Thus, clear insights into how mitochondrial dysfunction, oxidative stress and protein homeostasis systems interconnect, overlap or converge to produce nigral neuronal degeneration is essential to understand the pathogenesis of sporadic PD (sPD). In this thesis, we initially addressed the potential implications of an altered structural and functional crosstalk between mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER), two important metabolic organelles for the maintenance of cellular protein homeostasis. We reported that mitochondrial dysfunction induced by an acute stimulus of the neurotoxin MPP+ renders cells more susceptible to develop an ER stress response. We found that MPP+ was able to evoke a sustained flux of Ca2+ from the ER to mitochondria which subsequently triggered ER- and mitochondria-dependent apoptotic pathways. Our findings highlight the inevitable role of ER to mitochondria Ca2+ fluxes and their requirement for a mitochondria-dependent cell death induction, enclosing a feedback loop whereas mitochondria signals ER and ER induces further mitochondrial alterations, leading to the activation of cascade of signals that culminates in apoptotic cell death. Furthermore, we also found that ER stress response strengthens mitochondrial stress-induced abnormalities. We demonstrated that sustained ER stress caused by accumulation of unfolded or misfolded proteins potentiated Ca2+ overload and impairment of mitochondrial function mainly characterized by dissipation of mitochondrial membrane potential and substantial decline in the mitochondrial respiratory chain complex I activity. These cumulative events led to induction of apoptotic cell death. In addition, we assessed the role of mitochondrial metabolism in the regulation of the autophagy-lysosomal pathway, a major cellular homeostatic process that mediates the degradation of long-lived proteins and dysfunctional or superfluous organelles in eukaryotic cells. We demonstrated that prolonged metabolic failure due to mitochondrial dysfunction, either in cellular models harboring sPD subjects mtDNA (sPD cybrids), cells depleted of all mtDNA (Rho0 cells), or in MPP+-treated rat cortical neurons causes a functional decline in the activity of the autophagic system. This defect is a consequence of alterations in microtubules (MT) assembly that hamper mitochondria and autophagosome transport along the MT network toward the lysosomal compartment. Consequently, deficient autophagic turnover potentiates the accumulation of α-synuclein oligomers and, ultimately, prompts apoptosis. Our data identify for the first time the PDassociated defects in mitochondrial dysfunction as the basis for the selective transport abnormalities and highly characteristic pattern of neuritic dystrophy associated to the autophagic pathology in PD. Finally, we dissected the molecular mechanisms by which mitochondrial metabolism in sPD can affect MT-directed autophagic turnover that, in turn, regulates intracellular protein homeostasis. We demonstrated that sirtuin 2 (SIRT2), a NAD+ dependent protein deacetylase, controls the functional ability of the autophagic system by modulating the acetylation status of the MT cytoskeleton. The studies presented here provide novel insights into the multiple mechanisms that dictate the association between mitochondria, intracellular metabolism and proteotoxicity in sPD, and contribute with new findings that could have important therapeutic implications to halt or retard the progression of sPD pathology.

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, afectando cerca de 2% dos indivíduos com idade superior a 65 anos. A marca neuropatológica primária desta doença é a disfunção da via dopaminérgica nigroestriatal, da qual resulta a depleção de dopamina no cérebro, conduzindo aos principais sintomas motores que caracterizam a clínica da doença e que incluem tremor de repouso, bradicinesia, instabilidade postural e rigidez muscular. Outra característica neuropatológica da DP é a presença de corpos de inclusão intracelulares, designados de Corpos de Lewy, que são maioritariamente constituídos por α-synucleína na forma agregada. Embora a etiologia da doença permaneça por esclarecer, sabe-se que 90-95% dos casos de DP ocorrem de uma forma esporádica e pensa-se que, em parte, se correlacionam com a disfunção da mitocôndria e com o stresse oxidativo. A identificação de genes associados às formas familiares da DP revolucionou a forma de pensar dos investigadores da área, proporcionando oportunidades únicas para estudar novos mecanismos envolvidos na etiopatogenia da DP. O estudo continuado das funções celulares de cada um dos genes relacionados com a DP indica que o misfolding e a agregação proteica, bem como a disfunção dos sistemas de controlo de qualidade proteica, desempenham um papel crucial na cascata de eventos implicada no processo de neurodegeneração da DP. Assim, uma visão clara de como e quando a disfunção mitocondrial, o stresse oxidativo e os mecanismos de homeostase proteica se entrecruzam, sobrepõem ou convergem para produzir degeneração nigorestriatal é essencial para a compreensão da fisiopatologia da DP do tipo esporádico (sDP). Nesta tese, abordámos, inicialmente, as potenciais implicações das alterações na interação estrutural e funcional entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático (RE), dois organelos importantes envolvidos na manutenção da homeostase proteica celular. Reportamos que a disfunção mitocondrial induzida por um estímulo agudo da neurotoxina MPP+ aumenta a susceptibilidade das células para o desenvolvimento de uma resposta ao stresse do RE. Verificámos que o MPP+ foi capaz de evocar um fluxo contínuo de Ca2+ entre o RE e a mitocôndria, desencadeando, subsequentemente, a activação de vias apoptóticas dependentes do RE e da mitocôndria. Os resultados obtidos destacam o papel inevitável dos fluxos de Ca2+ entre o RE e a mitocôndria, e a sua relevância para a indução de morte celular dependente da mitocôndria, estabelecendo-se um ciclo de retrocontrolo em que a mitocôndria sinaliza o RE e o RE induz alterações posteriores na mitocôndria, conduzindo à activação de uma cascata de sinalização que culmina na morte celular por apoptose. Do mesmo modo, observámos que o stresse do RE potencia alterações ao nível da função mitocôndrial. Demonstramos que stresse do RE prolongado devido à acumulação de proteínas mal processadas no seu interior conduz a um fluxo excessivo de Ca2+ para o interior mitocôndria e a um comprometimento da função mitocondrial, caracterizada principalmente pela dissipação do potencial de membrana e por um decréscimo substancial da actividade da cadeia respiratória mitocondrial. Cumulativamente, estes eventos desencadeam a indução de morte celular por apoptose. Por outro lado, avaliámos o papel do metabolismo mitocondrial na regulação da via autofágica-lisossomal, um processo homeostático celular que medeia a degradação de proteínas de longa duração e organelos disfuncionais em células eucarióticas. Demonstramos que uma falência metabólica prolongada devido a disfunção mitocondrial quer em células híbridas portadoras de ADN mitocondrial de doentes de sDP (cíbridos sDP), em células depletadas do seu ADN mitocondrial (células Rho0) ou em culturas primárias de neurónios corticais de rato tratados com MPP+, provoca um declínio funcional na actividade do sistema autofágico. Este defeito é uma consequência de alterações estruturais na rede microtubular (MT), comprometendo o transporte de mitocôndrias e autofagossomas para o compartimento lisossomal, onde ocorre degradação. Consequentemente, um ineficaz turnover autofágico potencia a acumulação de oligómeros de α-sinucleína e, em última análise, desencadeia apoptose. Assim, os dados obtidos identificam pela primeira vez os defeitos na função mitocondrial associados à DP como a base para alterações específicas no transporte intracelular e no padrão característico da distrofia neurítica associado à patologia autofágica na DP. Por fim, analisámos os mecanismos moleculares através dos quais o metabolismo mitocondrial em sDP pode afectar o turnover autofágico dependente da rede MT, o qual, por sua vez, regula a homeostase proteica intracelular. Demonstramos que a sirtuina 2 (SIRT2), uma desacetilase citoplasmática dependente do NAD+, controla a capacidade funcional do sistema autofágico, modulando o estado de acetilação do MTs. Os estudos apresentados fornecem novas pistas relativamente aos múltiplos mecanismos que determinam a associação entre mitocôndria, metabolismo intracelular e proteotoxicidade e contribuem com novas perspectivas que poderão ter importantes implicações terapêuticas no sentido impedir ou retardar a progressão da sPD.