Approaches to Improve the Differentiation, Maturation and Biological Activity of Vascular Cells Derived from Stem Cells

Abstract

As células estaminais embrionárias humanas (hESCs) podem ser uma fonte ilimitada de células endoteliais e de músculo liso para medicina regenerativa, rastreio de compostos farmacológicos e ensaios de toxicologia. Nos últimos 10 anos têm sido feitos avanços significativos na diferenciação de hESC em células vasculares e algumas das estratégias têm sido implementadas recentemente na diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs). Um dos objectivos desta tese de doutoramento é desenvolver plataformas de diferenciação mais eficientes para obter células de músculo liso (SMC) e células endoteliais (EC) a partir de hESCs. A primeira parte deste trabalho (capítulo 3) demonstra que células CD34+ derivadas de hESC têm maior potencial em se diferenciar em SMCs que células CD34-. Das várias moléculas indutoras testadas, o ácido retinóico (RA) e o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFBB) mostraram ser os mais eficientes no direccionamento da diferenciação de células CD34+ em células progenitoras de músculo liso (SMPCs), caracterizadas pela expressão de genes e proteínas de SMC, secreção de citoquinas de SMC, contracção em resposta a agentes despolarizantes e péptidos vasoactivos e ainda à expressão de genes específicos de SMC em ambiente tri-dimensional. Essas células apresentavam baixa organização das proteínas contrácteis e a resposta contráctil mostrou ser mediada por Ca2+, envolvendo a activação das vias dependentes das cinases Rho A/Rho e Ca2+/calmodulina (CaM) /cadeia leve da miosina (MLCK). As SMPCs obtidas da diferenciação de células CD34+ com RA podem ser maturadas em meio suplementado com endotelina-1, mostrando no final filamentos contrácteis completamente individualizados e organizados. Na segunda parte do trabalho (capítulo 4), mostrou-se que hESCs cultivadas na presença de timosina 4, VEGF165 e o inibidor da via de sinalização TGF- (SB431542), adicionados em diferentes fases do processo de diferenciação, dão origem a células precursoras endoteliais que podem amadurecer em células endoteliais arteriais. As células expressam genes arteriais tais como JAG1, ephrin B1 e Hey-2 e a proteína arterial EphB2. As células respondem a fluxo arterial, alinhando-se na sua direcção e aumentando a expressão de genes arteriais. O processo provavelmente envolve o proteoglicano heparano sulfato (HSPG), um componente do glicocalix, o qual é activado pelo efeito de corte do fluido. Os resultados mostram que células endoteliais derivadas de hESCs possuem maior sensibilidade à terbinafine, uma droga antifungica, que células somáticas endoteliais. Células cultivadas em condições fisiológicas de efeito de corte possuem maior sensibilidade que células cultivadas em condições estáticas. Na terceira parte desta tese (capítulo 5) estudámos também novas abordagens de modulação de actividade vascular, através do factor de crescimento vascular endotelial (VEGF). Neste trabalho demonstrámos que VEGF conjugado ao dextrano (dexOx-VEGF) tem maior bioactividade intracellular em células endoteliais, quando comparado com VEGF livre. O dexOx-VEGF prolonga a fosforilação do receptor 2 de VEGF (VEGFR-2). Tanto o dexOx-VEGF como o VEGF livre activam VEGFR-2 e os complexos são internalizados nos endossomas primários (vesículas EEA1+) e depois transportados para os lisossomas (vesículas Rab7+). No entanto, após activação celular o dexOx-VEGF é preferencialmente co-localizado nos endossomas primários, onde a sinalização de VEGF ainda está activa; enquanto que o VEGF livre é preferencialmente transportado para os lisossomas. Os resultados mostram ainda que o dexOx-VEGF após a fosforilação do VEGFR-2 induz um aumento do Ca2+ intracelular e activa vias a jusante, tais como AKT e ERK1/2. O DexOx-VEGF pode ser integrado num gel de forma a ser incorporado em géis de fibrina que por sua vez contêm células endoteliais (derivadas de células do sangue de cordão umbilical humano), de modo a modular a sua actividade.

Human embryonic stem cells are an unlimited source of endothelial and smooth muscle cells for regenerative medicine, drug screening and toxicology assays. Significant advances have been made in the last 10 years in driving the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into vascular cells and some of the approaches have been implemented recently in the differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs). One of the aims of the PhD thesis was to develop more efficient differentiation platforms to obtain smooth muscle (SMC) and endothelial cells (EC) from hESCs. The first part of this thesis (chapter 3) shows that CD34+ cells derived from hESCs have higher SMC potential than CD34- cells. From all inductive signals tested, retinoic acid (RA) and platelet derived growth factor (PDGFBB) are the most effective agents in guiding the differentiation of CD34+ cells into smooth muscle progenitor cells (SMPCs) characterized by the expression of SMC genes and proteins, secretion of SMC-related cytokines, contraction in response to depolarization agents and vasoactive peptides and expression of SMC-related genes in a 3D environment. These cells are also characterized by a low organization of the contractile proteins and the contractility response is mediated by Ca2+, which involves the activation of Rho A/Rho kinase- and Ca2+/calmodulin (CaM) /myosin light chain kinase (MLCK)-dependent pathways. SMPCs obtained from the differentiation of CD34+ cells with RA, can be maturated in medium supplemented with endothelin-1 showing at the end individualized contractile filaments. In the second part of this thesis (chapter 4), our results show that vascular endothelial growth factor (VEGF165), thymosin "4 (T"4), and TGF-" inhibitor administered at different times over a 18 day-differentiation protocol can give rise to endothelial precursor cells that have the ability to differentiate into arterial ECs. The cells express arterial genes such as JAG1, ephrin B1 and Hey-2 and the arterial protein EphB2. The cells respond to arterial flow by aligning in the direction of the flow and further up-regulating the expression of arterial genes. The process is likely mediated by heparan sulfate proteoglycan (HSPG), a component of glycocalyx, which is activated by fluidic shear stress. Our results show that hESC-derived ECs have higher sensitivity to terbinafine, an antifungal drug, than somatic human umbilical arterial endothelial cells. Cells cultured under physiologic shear stress have higher sensitivity to terbinafine than cells cultured in static conditions. In the third part of the thesis (chapter 5) we also investigated new approaches to modulate vascular cell activity, through vascular endothelial growth factor. Our results show that VEGF functionalized dextran (dexOx- VEGF) has longer intracellular bioactivity in endothelial cells when compared to free VEGF. It prolongs the phosphorylation of VEGF receptor 2 (VEGFR-2). Both dexOx-VEGF and free VEGF activate VEGFR-2 and the complexes are internalized into early endosomes (EEA1+ vesicles) and then transported to lysosomes (Rab7+ vesicles). However, after cell activation dexOx-VEGF is preferentially co-localized in early endosomes where VEGF signaling is still active while soluble VEGF is preferentially transported to late endosomes or lysosomes. The results further show that dexOx-VEGF after phosphorylation of VEGF receptor 2 induces an increase of intracellular Ca2+ and activates VEGF downstream effectors such as Akt and extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) proteins. Under specific conditions the activation level is different from the one observed for soluble VEGF, thus suggesting mechanistic differences, which is illustrated by functional cell migration studies. DexOx-VEGF can be crosslinked with adipic acid dihydrazide to form a degradable gel, which in turn can be incorporated in a fibrin gel containing endothelial cells (derived from human cord blood) to modulate their activity.