Presynaptic A₂A adenosine receptors control CB₁ cannabinoid receptor-mediated effects at the corticostriatal nerve terminals

Abstract

The striatum is the main input nucleus of the basal ganglia, involved in motor control and different forms of learning. Corticostriatal glutamatergic afferents represent the principal excitatory drive to the striatum, and hence, to the whole basal ganglia. Several neurological and psychiatric disorders, including Parkinson's disease, psychosis and addiction, involve non-Hebbian alteration of corticostriatal plasticity; thus, it is important to study the signaling systems which keep these terminals controlled. Dopamine, originated from midbrain areas is the best known signal shaping corticostriatal plasticity. Besides, the intrinsic modulators, adenosine, acting on A2A adenosine receptors (A2ARs), and endocannabinoids, acting on CB1 cannabinoid receptors (CB1Rs), also play key roles in the modulation of corticostriatal neurotransmission. A2ARs and CB1Rs are required for the correct functioning of the basal ganglia and are emerging therapeutic targets in neurological and psychiatric disorders. One of the best examples is the A2AR antagonist, Istradefylline, with the intention to be used as a palliative medicine adjunct to levodopa. Recently, A2ARs and CB1Rs were shown to heteromerize, but the physiopharmacology of this novel signaling entity is controversial. Furthermore, although several reports found both receptors in corticostriatal terminals, their co-localization and functional interaction to control glutamate release has not been investigated. The objective of my thesis work was to study the functional co-localization of A2ARs and CB1Rs in vGlut1-positive, i.e. corticostriatal terminals of the rat and mouse. It was observed that most of the A2ARs in vGluT1-positive terminals colocalize with CB1Rs, which assumes functional interaction. The high co-localization rate between A2ARs and CB1Rs has led to the investigation of possible cross-modulation of the binding properties between the CB1R and the A2AR in striatal synaptic membrane preparation. It was found that the interaction is unidirectional, i.e. A2AR ligands are able to negatively modulate CB1R maximum binding sites or affinity but not vice versa, i.e. CB1R ligands failed to XV significantly affect A2AR binding parameters. This indicates that A2AR ligands may be able to modulate CB1R-dependent mechanisms in corticostriatal terminals. The next task was to assess the neurochemical consequences of the observed interactions. First, the effect of CB1R activation on the K+-evoked, Ca2+-dependent release of [14C]glutamate from striatal nerve terminals of the rat and mouse was established. CB1R activation inhibited the evoked release of [14C]glutamate in accordance with previous reports. According to the above mentioned binding data, the co-administration of A2AR ligands, irrespective of being agonist or antagonist, prevented the inhibitory action of CB1R agonists on the evoked release of [14C]glutamate. Adenosine acting on A2ARs is thought to result from the breakdown of extracellular ATP, which is co-released with glutamate. Thus, it is expected that CB1R activation would also decrease extrasynaptic ATP accumulation in the striatum. Indeed, bioluminescence assay revealed that CB1R activation decreased the K+-evoked release of ATP in striatal nerve terminals. Thus, although at the receptor-receptor level only A2ARs control CB1Rs, CB1Rs are able to indirectly interfere with A2AR functioning by decreasing the release of the adenosine source, ATP. In order to confirm the interaction at the presynaptic level, whole cell patch clamp electrophysiological experiments were carried out in corticostriatal slices from the rat. Two parameters were measured in this experimental paradigm: paired pulse ratio (PPR) which is thought to be a presynaptic phenomenon, and synaptic transmission which may encompass post-synaptic as well as glial mechanism. Therefore, the alterations of the PPR will give the most reliable conclusion about a presynaptic nature of the measured effect. The removal of the majority of extrasynaptic adenosine by adenosine deaminase (ADA) facilitated the CB1R activation-induced increase in PPR, but counteracted the CB1R-mediated depression of corticostriatal neurotransmission. These apparent paradoxical results might be the outcome of the different functions of pre- versus post-synaptic A2ARs in controlling CB1Rs. In addition, since XVI exogenous activation of A2ARs did not recover the effect of CB1Rs on synaptic transmission, it is likely that another adenosine receptor is involved, in particular, the A1Rs. Furthermore, as expected from the above-detailed functional studies, A2AR ligands counteracted the CB1R activation-induced increase in PPR, and also compromised the CB1R-mediated depression of corticostriatal neurotransmission. In conclusion, the data presented in this thesis provide the first evidence for the co-localization of the two major neuromodulator receptors at the corticostriatal terminals. The two receptors interact closely at these terminals, with important functional consequences, which is likely to have therapeutic implications.

O estriado é a principal estação de entrada de informação dos gânglios da base, e está envolvido no controlo de diferentes formas de aprendizagem. Os aferentes córtico-estriatais funcionam como a força motriz do estriado, e portanto dos gânglios da base também. Alterações a nível da transmissão e plasticidade sináptica nesses terminais estão envolvidas na fisiopatologia de diversas doenças neuropsiquiátricas, incluindo a doença de Parkinson, a psicose e a toxicodependência. Assim, é de extrema importância estudar os sistemas de sinalização que modulam a actividade desses terminais. A dopamina, com origem no mesencéfalo, é o neuromodulador mais conhecido a exercer controlo sobre plasticidade sináptica nos terminais córtico-estriatais. Para além da dopamina, outros neuromoduladores também desempenham um papel fundamental nesses terminais. Dentre os vários neuromoduladores, encontram-se a adenosina, actuando nos receptores A2A, e os endocanabinóides, actuando nos receptores CB1. Os receptores A2A e os receptores CB1R são necessários para o correcto funcionamento dos gânglios da base. Ambos os receptores são alvos terapêuticos promissores em várias desordens neuropsiquiátricas que afectam os gânglios da base. Um dos melhores exemplos é o antagonista dos receptores A2A, de nome Istradefylline, que se encontra em ensaios clínicos com a intenção de ser usado como medicamento paliativo adjunto da levodopa. Foi recentemente descoberto que os receptores CB1R e os receptores A2A formam heterómeros quando co-expressos. Contudo, a farmacologia e as consequências fisiológicas desta nova entidade sinalizadora continuam envoltas em controvérsia. Embora vários estudos mostraram a presença de ambos os receptores nos terminais cortico-estriatais, a sua co-localização e a interação funcional com o intuito de controlar a libertação de glutamato nunca foi investigado. Assim, esta tese teve como principal objectivo o estudo da co-localização e possível interacção entre os receptores de adenosina A2A e os receptores de canabinóde CB1, bem como as consequências funcionais sobre a transmissão córtico-estriatal. XVIII Os estudos de quantificação dos níveis de receptores A2A e CB1 que se encontram co-localizados nos terminais córtico-estriatais, mostraram que a maioria dos terminais que continha os receptores A2A, também continha receptores CB1, o que por si só sugere algum tipo de interacção funcional. Assim, o passo seguinte foi fazer ensaios de ligação ao receptor, com o intuito de verificar se os dois receptores exercem algum tipo de controlo entre si. Desses ensaios concluiu-se que os ligandos dos receptores A2A modulam negativativamente o número máximo dos locais de ligação e a afinidade dos receptores CB1R. O contrário não se verificou, isto é, os ligandos dos receptores CB1 não afectaram os parâmetros de ligação do radioligando aos receptores A2A. Estes resultados sugerem que os ligandos dos receptores A2A podem modular os mecanismos dependentes dos CB1Rs nos terminais cortico-estriatais. As consequências neuroquímicas das interações observadas nos ensaios de ligação foram investigadas em ensaios de libertação de glutamato e ATP. Como é sabido, a activação dos receptores CB1 inibe a libertação de glutamato. A co-aplicação dos ligandos do receptor A2A, tanto agonistas como antagonistas, preveniu a acção dos agonistas dos receptores CB1 sobre a libertação evocada de glutamato. O ATP, libertado em conjunto com o glutamato, é considerado a principal fonte de adenosina que actua nos receptores A2A para modular a transmissão sináptica. É esperado que a activação de CB1 também provoque um decréscimo na acumulação de ATP extra-sináptico no estriado. Os ensaios de bioluminescência revelaram que a activação dos eceptores de CB1 diminui a libertação evocada de ATP em sinaptossomas do estriado. Com o objectivo de confirmar a localização pré-sináptica das interações observadas, realizou-se ensaios de electrofisiologia onde se mediu o efeito da adenosina endógena e o efeito dos ligandos dos receptores de A2A sobre respostas sinápticas desencadeadas pela activação dos receptores CB1, nomeadamente o aumento do rácio dos pulsos emparelhados (paired pulse ratio – PPR) e o decréscimo na transmissão sináptica. Alterações no PPR é uma indicação de que o efeito observado ocorre a nível pré-sináptico. XIX A remoção da maioria da adenosina extra-sináptica pela adenosina desaminase facilitou o aumento de PPR induzido pela activação dos receptores de CB1. Em contraste, a depressão da transmissão sináptica induzida pela activação dos receptores CB1 foi prevenida. Estes resultados aparentemente contraditórios podem ser o resultado da existência de diferentes populações de receptores, em diferentes compartimentos sinápticos ou até mesmo em diferentes tipos de terminais nervosos. Uma vez que a activação dos receptores A2A na presença da adenosina desaminase não recuperou o efeito da activação dos receptores CB1 sobre a transmissão sináptica, é bastante provável que outro receptor de adenosina se encontre envolvido, particularmente os receptores A1 que também estão nos terminais cortico-estriatais a controlar a libertação de glutamato. À semelhança do que aconteceu com os ensaios de ligação ao receptor e os ensaios de libertação de glutamato, os ligandos do receptor A2A preveniram o aumento do PPR e a depressão sináptica mediada pelos receptores CB1. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese fornecem pela primeira vez a evidência de que os recetores A2A e CB1 estão co-localizados nos terminais córtico-estriatais, onde estabelecem interações funcionais, com possíveis implicações terapêuticas.