The role of metabolism and mitochondrial function in embryonic stem cells

Abstract

As células estaminais pluripotentes são capazes de se diferenciar em todos os tipos celulares presentes num organismo adulto. Por esta mesma razão, estas células, representam um potencial tremendo quer para estudos de diferenciação, quer para um possível futuro na terapia celular. Contudo, o risco de indução de tumores devido a diferenciações incompletas compromete este objectivo. Desta forma torna-se imperativo o desenvolvimento de estudos extensivos que permitam compreender a fisiologia da célula estaminal pluripotente. Conhecendo as suas propriedades metabólicas e mitocondriais, será possível garantir diferenciações mais bem sucedidas, eliminando o risco mencionado. O facto de alguns tipos de tumores apresentarem características comuns com células estaminais pluripotentes levanta a questão se em termos metabólicos essa semelhança se mantêm. Assim sendo, o principal objectivo desta tese consiste em testar a hipótese que tanto o metabolismo como a função mitocondrial são fulcrais para a pluripotencia de células estaminais pluripotentes. Os resultados de investigação cientifica aqui apresentados foram obtidos utilizando dois tipos de células pluripotentes: células estaminais embrionárias e células estaminais pluripotentes induzidas. O trabalho experimental encontra-se dividido em três objectivos distintos e os resultados estão descritos ao longo dos capítulos, três, quatro e cinco. ‘E importante ter em conta, que aquando do inicio deste trabalho pouco se sabia sobre a função mitocondrial de células estaminais embrionárias, e relativamente ao estado metabólico destas células a literatura disponível era ainda mais escassa. Tendo estes factores em mente, o primeiro objectivo prendeu-se com a caracterização da função mitocondrial e estado metabólico nestas células, bem como o de células diferenciadas a partir delas. Relativamente a mitocondria, foram avaliadas a localização, morfologia e a actividade deste organelo foram avaliadas. Estudos de expressão genética foram realizados de modo a inferir sobre o estado geral de vias metabólicas como sendo a glicolise, via das pentoses fosfato e o ciclo do acido tricarboxilico. Por ultimo, baseando-nos na possível similaridade com células tumorais, avaliamos os níveis de proteína para alguns elementos chave envolvidos na regulação metabólica. Os resultados obtidos permitem concluir que a assinatura metabólica das células estaminais pluripotentes induzidas não ‘e igual a de células estaminais embrionárias. Contudo estes dois tipos de células estaminais agrupam-se aquando da analise da expressão genética. A analise da actividade mitocondrial permitiu obter valores de ATP, lactato e consumo de oxigénio compatíveis com um perfil metabólico glicolitico. Curiosamente, no seu conjunto, os resultados realçam algumas possíveis estratégias para manter níveis elevados de glicolise, como sendo níveis proteicos elevados de Hexokinase II e uma piruvato desidrogenase inactiva. Artigos científicos recentes provaram que para haver reprogramação de uma célula somática a célula pluripotente, primeiro o metabolismo dessa célula terá de se tornar glicolitico e só apos esta alteração ‘e que os genes responsáveis pelo estado de pluripotencia são activados. Para alem disso, outros estudos demonstraram que a manipulação da via das pentoses fosfato permite um controlo na diferenciação celular. No seu conjunto, estes estudo reenfocaram a nossa hipótese central e por isso mesmo, os nossos objectivos seguintes centraram-se na inibição farmacológica dos dois alvos identificados no primeiro objectivo. Com o intuito de bloquear o primeiro passo da glicolise, a Hexokinase II foi inibida recorrendo ao fármaco 3-Bromopiruvato que actualmente ‘e usado em ensaios clínicos na luta contra o cancro. A pluripotencia foi avaliada, bem como a função mitocondrial. No geral, foi possível concluir que a pluripotencia foi afectada sem uma alteração metabólica obvia. No entanto, foi possível observar um efeito negativos a nível proteico para p53 e c-Myc. Como controlo para as nossas experiencias, crescemos células sem LIF que ‘e essencial para a pluripotencia. Em normoxia a glicose ‘e convertida a piruvato que, por sua vez, pode ser metabolizado na mitocondria pela piruvato desidrogenase (PDH) originando acetil- coenzimA. Esta enzima possui uma subunidade (E1-α) que funciona como um interruptor regulado por processos de fosforilacao/desfosforilacao. A enzima responsável pela fosforilacao e consequente inibição, da PDH ‘e a piruvato desidrogenase cinase que possui quatro isoformas (PDHK1-4). Uma vez que os resultados no primeiro objectivo demonstram que uma forma inactiva da PDH poderá ser benéfica para as células estaminais pluripotentes, o ultimo objectivo consistiu em clarificar se a inibição da PDHK poderia comprometer a pluripotencia nestas células. A actividade da PDHK foi inibida recorrendo ao fármaco acido dicloroacetico (DCA), que também se encontra em ensaios clínicos oncológicos. Os resultados obtidos permitem concluir que na presença de DCA as células estaminais embrionárias começam a diferenciar demonstrando alterações na função mitocondrial bem como na sua capacidade de proliferação. Para alem de um efeito negativo na pluripotencia os resultados presentes neste capitulo permitem inferir sobre possíveis vias activas na regulação metabólica nestas células, demonstrando mais uma vez, a semelhança com as células tumorais e que ao regular o estado da PDH, PDHK poderá funcionar como um elemento chave na regulação metabólica constituindo um possível alvo para modulação do mesmo. Como conclusão geral, podemos inferir que efectivamente, as células estaminais embrionárias beneficiam de um metabolismo mais glicolitico com uma PDH inactiva e que uma perturbação nestes factores leva ‘a perda de pluripotencia. Curiosamente, as vias de sinalização possivelmente envolvidas nesta regulação são efectivamente semelhantes as presentes em células tumorais. De um modo geral, os resultados presentes nesta dissertação permitem um esclarecimento sobre o status/regulação metabólica nestas células e demonstra que uma actividade normal de enzimas como a Hexokinase II e PDHK são importantes para a pluripotencia celular.