Hexavalent Chromium and Cancer Stem Cells: a view to a kill!

Abstract

Contornando os avanços científicos feitos nas últimas décadas, o cancro prevalece como um grande problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas por todo o mundo. O avanço mais recente feito no campo da oncobiologia foi a descoberta das células estaminais tumorais (CETs) e do seu envolvimento na doença metastática, a principal causa de morte em doentes oncológicos. Subsequentemente ficou demonstrado que as CETs regulam a tumorigenicidade e o grau de diferenciação tumoral, sendo ainda responsáveis pela resistência às terapias convencionais e pelas recidivas. Mais recentemente foram desenvolvidas terapias direcionadas especificamente a estas células que, no entanto, não surtiram o efeito esperado, uma vez as CETs conseguem regenerar- se por dediferenciação a partir de outras células do tumor. Os mecanismos subjacentes ao processo de dediferenciação são ainda desconhecidos, constituindo a sua caracterização parte dos objetivos deste trabalho. O cancro do pulmão é uma das neoplasias mais frequentes. A sua prevalência tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido ao acréscimo dos hábitos tabágicos e à acumulação de poluentes atmosféricos. Neste trabalho utilizou-se o crómio hexavalente [Cr(VI)], um agente carcinogénico cujos níveis atmosféricos e relevância ocupacional têm aumentado significativamente nos últimos anos. Para os nossos estudos selecionámos uma linha celular não maligna de epitélio bronquial humano (BEAS-2B), a qual foi malignizada por cultura a baixa densidade na presença de Cr(VI), originando a linha celular RenG2. Em paralelo, uma linha controlo cultivada a baixa densidade na ausência de Cr(VI) (Cont1) foi também estabelecida. Visando aumentar o seu potencial maligno, as células RenG2 foram injetadas em murganhos imunocomprometidos e uma nova linha celular (DRenG2) foi estabelecida a partir do tumor formado. Este processo foi repetido com as células DRenG2, tendo-se obtido as células DDRenG2. Diversas técnicas de biologia celular e molecular foram então utilizadas para caracterizar os vários sistemas celulares, tendo os resultados obtidos sugerido o envolvimento de CETs na malignização das células BEAS-2B. Esta hipótese foi testada usando o ensaio de formação de esferas, no qual se observou a formação de colónias SC-DRenG2 e SC-DDRenG2, apenas nos dois sistemas derivados, DRenG2 e DDRenG2, respetivamente. Os resultados obtidos sugeriram que a formação de CETs na população de RenG2 injetada em murganhos imunocomprometidos decorreu de um processo de dediferenciação, provavelmente orquestrado pelas células do estroma do compartimento subcutâneo do animal. Para testar esta teoria, foram isoladas cirurgicamente células da região lombar de murganhos singénicos aos anteriores, e uma linha primária de fibroblastos (FR) foi estabelecida. A sua subsequente co-cultura com as células RenG2 durante dois meses levou à formação de uma população de CETs no seio das células RenG2 isoladas (iRenG2), cuja posterior caracterização mostrou serem mais semelhantes às DRenG2 e SC-DRenG2 do que às suas progenitoras RenG2. Por fim, o estudo dos meios condicionados das células em co-cultura identificou a Interleucina-6 (IL-6), o Factor estimulador de colónias derivado de granulócitos (G-CSF) e a Activina-A como potenciais mediadores parácrinos do processo de dediferenciação induzido pelas células do estroma do murganho.

Bypassing all the research advances made in the last decades, cancer remains as a major public health problem affecting millions of people worldwide. The most recent advance in the tumor biology field was the discovery of cancer stem cells (CSCs) and of their implication in the metastatic disease, the main cause of cancer patients’ mortality. CSCs were shown to drive tumorigenesis and differentiation, contributing to tumors’ heterogeneity and to their chemo- and radiotherapy resistance and eventually relapse. Although targeted therapeutic approaches have been developed to abolish them, CSCs managed to reemerge through dedifferentiation of other tumor cells, condemning these therapies. The mechanisms behind dedifferentiation process are still unclear and were part of the main focus of this project. Lung cancer is one of the most common neoplasias worldwide. Its prevalence is increasing due to the widespread smoking habits and increasing accumulation of atmosphere pollutants. In this work hexavalent chromium [Cr(VI)] was selected as a model for lung carcinogenesis mainly due to is increasing occupational relevance. The nonmalignant human bronchial epithelial airway system 2B (BEAS-2B) was malignantly transformed into the RenG2 cell line using low density culture in the presence of Cr(VI). A parallel control cellular system (Cont1) was produced under the same conditions, though, in the absence of Cr(VI). Two additional derivative cell lines were attained following serial rounds of injection in immunocompromised mice, and named DRenG2 and DDRenG2, respectively. A panoply of techniques was then used to characterize the attained cellular systems leading to the hypothesis of CSCs involvement in Cr(VI)-driven BEAS-2B malignant transformation. The sphere-formation assay tested this hypothesis and allowed the isolation of CSC spheres (SC-DRenG2 and SC-DDRenG2 cells, respectively), but only from the derivative cell lines. These results suggested that a dedifferentiation process featured CSCs’ formation during RenG2 derivation in nude mice. The involvement of the mouse stroma in the dedifferentiation process was uncovered by surgical isolation of lumbar stromal cells (FR fibroblasts) from the subcutaneous compartment and their subsequent co-culture with RenG2 cells. Following two months, RenG2 cells were isolated from the upper compartment (iRenG2) and tested for their ability to form spheres. Gene and protein expression analysis were used to compare iRenG2 cells’ signature with those of RenG2, DRenG2 and SC-DRenG2, showing that iRenG2 cells were no longer similar to RenG2 but rather more close to both DRenG2 and SC-DRenG2. Finally, the study of the conditioned media from co-cultured cells identified interleukin-6 (IL-6), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and Activin-A as the potential paracrine orchestrators of this stromal-induced dedifferentiation process.