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https://hdl.handle.net/10316/24354
Title: | Resposta de macrófagos murinos à fagocitose de Cryptococcus neoformans | Authors: | Coelho, Carolina Isabel Paiva | Orientador: | Gonçalves, Teresa Casadevall, Arturo |
Issue Date: | 9-Sep-2013 | Citation: | COELHO, Carolina Isabel Paiva - esposta de macrófagos murinos à fagocitose de Cryptococcus neoformans. Coimbra : [s.n.], 2013. Tese de doutoramento | Place of publication or event: | Coimbra | Abstract: | Os macrófagos têm a capacidade de rapidamente fagocitarem Cryptococcus neoformans (Cn). Estas células
do sistema imunitário são cruciais na defesa, latência e reactivação da criptococose. Após fagocitose de Cn, foi
descrito um aumento da proliferação dos macrófagos. No entanto, a interação do fungo com o hospedeiro
resulta maioritariamente em dano para o macrófago, nomeadamente pela formação de um vacúolo gigante , o
aumento de vacúolos citosólicos, uma alteração da morfologia, designada por “Hueco cell” e a permeabilização
dos fagossomas. Para uma melhor compreensão da virulência de Cn, torna-se necessário elucidar a origem e a
mecanística destes danos celulares, que culminam frequentemente na morte do macrófago. Nas células
eucarióticas, tanto a morte como a proliferação são decisões celulares tomadas após integração de sinais da
mitocôndria. Para além disso, apesar da mitocôndria ter sido implicada na resposta imune antimicrobiana, não
existem ainda estudos no contexto das infecções fúngicas.
Este trabalho propôs-se a expandir o conhecimento existente da interacção entre macrófagos e Cn. Para tal,
foi estudado o ciclo celular de macrófagos murinos após infecção prolongada com Cn e em seguida, foi
caracterizado o tipo de morte que ocorre no macrófago. Dado que a mitocôndria está envolvida na morte
celular, este trabalho prosseguiu no sentido de averiguar modificações da função mitocondrial após a fagocitose
de Cn.
Para a concretização dos objetivos, desenvolveu-se um protocolo de microscopia automatizada (“Laser
Scanning Microscopy”) que facilitou as quantificações de eventos celulares observados por microscopia. Este
protocolo mostrou que o macrófago, após uma resposta inicial de proliferação, sofreu um bloqueio no ciclo
celular seguido por activação de vias metabólicas de morte. Foi igualmente observado que, mesmo em
condições de bloqueio do ciclo celular causado por IFN-γ e LPS, a fagocitose de Cn é suficiente para reverter
esse bloqueio. Foi possível observar a proliferação de macrófagos in vivo, o que demonstrou que macrófagos
residentes nos alvéolos pulmonares são capazes de divisão celular, em condicões de homeostase ou de
inflamação. O modelo experimental utilizado neste estudo não foi conclusivo acerca da existência de bloqueio
de ciclo celular após infecção pulmonar por Cn. In vitro, a morte de macrófagos primários derivados de medula
óssea ocorre pela ativação de caspase-1 e caspase-3 e AIF ( “Apoptosis Inducing Factor” ), o que sugere a
activação simultânea de morte por apoptose e por necroptose. Em células J774.16, uma linha celular de
macrófagos murinos, foi detectada necroptose mediada por RIP (“Receptor Interacting Protein”). Foi
verificada, em ambos os tipos de células, uma redução no potencial mitocondrial, acompanhado por uma
diminuição na concentração celular de ATP. Estes resultados foram reproducidos em macrófagos de origem peritoneal. Foi igualmente demonstrada uma correlação entre a presença de cápsula fúngica e modulação de
potencial mitocondrial na célula hospedeira.
Em resumo, os nossos resultados estabelecem a indução de respostas de estresse em resposta à fagocitose
de Cn por macrófagos. Estas incluem o bloqueio do ciclo celular, a ativação de caspases e a diminuição do
potencial mitocondrial, acompanhadas pela indução de moléculas efectoras de morte celular. Os resultados
consolidam um papel activo da mitocôndria na fagocitose e na resposta imune. Estes mecanismos representam
um passo importante na compreensão da patogénese de Cn. A longo prazo, estes resultados sugerem novos alvos
terapêuticos, necessários ao incremento do prognóstico da infeção por Cn. Murine macrophages readily ingest Cryptococcus neoformans (Cn) and are known to play a crucial role in host defense, fungal latency and reactivation of infections. Phagocytosis of Cn by macrophages leads to increased macrophage proliferation, but mostly it causes macrophage damage, in the form of giant vacuole formation, cytosolic vacuoles in the form Hueco cell and phagosomal leakage. Understanding the cause of these injuries provides an insight into Cn virulence and disease. Decisions of cell death, survival or proliferation are frequently integrated by the mitochondria. Further, this organelle has been shown to participate in antimicrobial immunity, but thus far, no studies have been performed for fungal infections. In this work, we proposed to expand current knowledge on the murine-macrophage-Cn interaction. Specifically, we studied macrophage cell cycle after prolonged Cn infection and then proceeded to characterize macrophage death modalities. Our evidence pointed to mitochondrial involvement in death and as such, we next investigated macrophage modulation, upon Cn ingestion. To aid our studies, we developed a new protocol based on Laser Scanning Cytometry (LSC), which facilitated quantification of microscopic events. Using LSC, we showed that initial proliferation is a conserved response to phagocytosis, but at later time intervals there was cell cycle arrest and death. Furthermore, phagocytosis of Cn was sufficient to suppress IFN-γ and LPS cell cycle arrest. Macrophage proliferation in vivo was observed, demonstrating that resident alveolar macrophages are capable of cell division, both as part of tissue homeostasis and of the inflammatory process. However, the in vivo experimental model did not detect toxic effects of Cn in macrophage proliferation. Investigation of effector molecules of death detected activation of caspase-1, caspase-3 and AIF in primary bone marrow derived macrophages, suggesting the occurrence of apoptosis and Apoptosis inducing factor-mediated necroptosis. In an immortalized murine macrophage cell line, we showed Receptor Interacting Protein-mediated necroptosis. We verified a decrease in mitochondrial potential after phagocytosis of Cn, that was accompanied by a decrease in ATP content of the cells. These results were further reproduced in peritoneal macrophages. We also showed a correlation between presence of fungal capsule and mitochondrial modulation in the host. In summary, this dissertation established induction of stress responses in macrophages after Cn infection. These included cell cycle arrest, caspase activation and decreased in mitochondrial potential, accompanied by induction of cell death effectors. Our results cement a role for mitochondria in phagocytosis and immunity. These mechanisms are a step towards better understanding of Cn pathogenesis. Ultimately, it would provide us with immunological targets, that are needed to improve poor prognosis of Cn infection. |
Description: | Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/24354 | Rights: | openAccess |
Appears in Collections: | FMUC Medicina - Teses de Doutoramento |
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