Interplay between Alpha-Synuclein and Oxidative Stress in Parkinson´s Disease Cell Models

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the most common motor and age-related neurodegenerative disorder affecting more than 1% of the population above age 65. Neurologically, PD patients present symptoms of progressive deterioration of tremor, rigidity of movements, bradykinesia and postural instability. The major neuropathological features of the disease are characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SN) and the formation of intracytoplasmic inclusions, called Lewy bodies (LBs), which are mainly composed by alpha-synuclein (alpha-syn). Despite the efforts over the years, the etiopathogenesis of PD is still not fully understood. 95% of cases are sporadic and result from a combination of environmental factors and genetic susceptibilities. The remaining 5% are the result of genetic mutations, including in the alpha-syn gene, which is involved in autosomal dominant inherited forms of PD. Nevertheless, sporadic and genetic forms of PD share common processes, namely oxidative stress and mitochondrial dysfunction, which have been of great interest to understand the mechanisms involved in dopaminergic neurodegeneration in PD. In this study, we modelled mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PD, respectively, by using rotenone, a complex I inhibitor of the mitochondrial respiratory chain and iron (FeSO4), a classical oxidative stress inducer, in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, expressing wild-type (WT) or mutant A53T alpha-syn, using two different systems of protein overexpression. In the first part of the work, we focused on the effect of mutant A53T versus WT alpha-syn modifications in transiently transfected SH-SY5Y cells and analysed the susceptibility of these cells to prolonged exposure (4 days) to iron (FeSO4) and rotenone on the generation of reactive oxygen species (ROS) and its correlation with cell death, formation of alpha-syn inclusions and alpha-syn phosphorylation at serine (Ser) 129. Our data showed that mutant A53T alpha-syn increased ROS levels, ubiquitin (Ub)-labelled alpha-syn aggregates, Abstract 30 phosphorylation at Ser129 and a decrease in protein phosphatase 2A (PP2A) activity, when compared to WT alpha-syn. Furthermore, prolonged exposure to iron or rotenone, enhanced the production of ROS in cells expressing WT or mutant A53T alpha-syn, which correlated with alpha-syn inclusion formation, Ser129 phosphorylation and mitochondrial depolarization. Our data suggest that enhanced ROS formation is associated with alpha-syn aggregation and phosphorylation at Ser129, in particular mutant A53T alpha-syn, which may precede degeneration of PD affected cells. Next, we used the neuroblastoma cell line SH-SY5Y overexpressing WT alpha-syn in a doxycycline (Dox) regulated manner, in a Tet Off system. Here, we correlated the occurrence of oxidative stress in cells inducibly overexpressing WT alpha-syn (-Dox) before and after short exposure (2 h) to iron. We gave evidence for raised ROS generation under basal conditions in cells overexpressing WT alpha-syn, compared to cells expressing the endogenous protein (+Dox), without changes in cell reducing capacity or alterations in the levels of apoptotic proteins. Furthermore, increased ROS levels were closely related with a decrease in the activities and levels of proteins involved in the antioxidant defense pathways, namely superoxide dismutase 1 (SOD1), SOD2, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG), while enzymes of the glutathione redox cycle were unchanged. Accordingly, the levels of the catalytic subunit of glutamate-cysteine ligase (GCLc) were also diminished. Further analysis of nuclear fractions demonstrated that nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), which activates the gene transcription of these antioxidant enzymes following mild intracellular ROS production, showed decreased levels in –Dox cells. Short treatment with iron, although largely augmenting ROS production in both +Dox and –Dox cells, triggered a significant increase in the levels and activities of these antioxidant proteins, apparently independently of alpha-syn overexpression, suggesting a compensatory intrinsic defense mechanism against short oxidizing stimulus. Finally, we investigated the role of WT alpha-syn expression in mitochondrial dysfunction, strongly associated with PD pathology. Using the same cellular model regulated by Dox, we showed that cells overexpressing alpha-syn and retaining high amount of alpha-syn in Abstract 31 mitochondria, displayed increased levels of mitochondrial superoxide anion, which were not triggered by treatment with iron. Accordingly, mitochondria from –Dox cells showed a significant decrease in the activity of complex I of the respiratory chain, with no changes in citrate synthase activity, corroborating previous studies concerning mitochondrial dysfunction and PD pathogenesis. Moreover, we did not find changes in mitochondrial transcription factor A (TFAM) or peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1alpha) between +Dox and –Dox cells. In addition, we observed a reduction in SOD1 activity in mitochondrial fractions of –Dox cells, which was exacerbated by iron. In contrast, mitochondrial SOD2 activity was not affected under basal conditions in –Dox cells, but was highly increased upon iron treatment. GSH and GSSG remained decreased in mitochondrial fractions from –Dox cells in untreated conditions, while iron did not affect the levels of this endogenous antioxidant. These data show that enhanced alphasyn in mitochondria may decrease the activity of mitochondrial complex I and promote mitochondrial ROS production, which may be boosted due to low antioxidant defenses in the organelle. Overall, these studies add relevant information on a close relationship between overexpression and post-translational modifications (e.g. phosphorylation) of WT and mutant alpha-syn and oxidative stress-related mechanisms, including cellular and mitochondrial antioxidant defense pathways. Thus, the data reveal the importance of developing neuroprotective strategies targeted at the transcription level, in order to prevent the imbalance in the redox homeostasis that trigger subsequent neurodegenerative events in PD.

A doença de Parkinson (PD, do inglês ‘Parkinson’s disease’) é a doença neurodegenerativa mais comum associada ao movimento e à progressão da idade, que afeta atualmente mais de 1% da população acima dos 65 anos de idade. Em termos neurológicos, os doentes de Parkinson apresentam sintomas de tremor incontrolado, rigidez de movimentos, bradicinésia e instabilidade postural. As principais características neuropatológicas desta doença incluem uma progressiva degenerescência dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta (SN) e a formação de inclusões intracitoplasmáticas denominadas corpos de Lewy, maioritariamente compostas por alfa-sinucleína (alfa-sin). Apesar dos esforços ao longo dos anos, a etiopatogénese da PD não está ainda completamente esclarecida. 95% dos casos são esporádicos e resultam de uma combinação entre fatores ambientais e suscetibilidades genéticas, enquanto os restantes 5% se devem a mutações genéticas, incluindo no gene da alfa-sin, que está envolvido numa das formas hereditárias autossómicas dominantes da PD. Não obstante, as formas esporádica e genética da PD partilham processos comuns, nomeadamente os relacionados com o stresse oxidativo e a disfunção mitocondrial, que têm constituído elevado interesse na compreensão dos mecanismos envolvidos na neurodegenerescência dopaminérgica na doença. Neste trabalho foram modeladas situações de disfunção mitocondrial e de stresse oxidativo na PD, respetivamente, usando rotenona, um inibidor do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial e ferro (FeSO4), um indutor clássico de stresse oxidativo, numa linha celular humana de neuroblastoma (SH-SY5Y), em que se induziu a expressão de alfa-sin na sua forma wild-type (WT) ou mutante (A53T), utilizando dois sistemas diferentes de sobreexpressão de proteínas. Na primeira parte do estudo, focámo-nos no efeito das modificações da alfa-sin mutante A53T versus WT em células SH-SY5Y transfetadas de forma transitória e analisámos a sua suscetibilidade a uma exposição prolongada (4 dias) a ferro (FeSO4) e a rotenona na Resumo 33 produção de espécies reativas de oxigénio (ROS, do inglês ‘reactive oxygen species’) e a sua correlação com a morte celular, formação de inclusões e fosforilação do resíduo de serina (Ser) 129 da alfa-sin. Os resultados obtidos revelaram que a expressão de alfa-sin A53T mutante induziu um aumento dos níveis de ROS, de agregados compostos por alfa-sin e ubiquitina, da fosforilação da Ser129 e uma diminuição da atividade da proteína fosfatase 2A (PP2A, do inglês ‘protein phosphatase 2A’), quando comparada com células que expressavam alfa-sin WT. Além disso, verificou-se um aumento exacerbado da formação de ROS em células que expressavam alfa-sin WT ou A53T mutante após a exposição prolongada a ferro ou rotenona, que se correlacionou com a formação de inclusões de alfasin, fosforilação da Ser129 e despolarização mitocondrial. Estes dados sugerem que a elevada produção de ROS está associada à agregação e fosforilação da alfa-sin no resíduo de Ser129, em particular no caso da alfa-sin A53T mutante, que pode eventualmente preceder a degeneração das células afetadas na PD. Na abordagem seguinte do trabalho experimental utilizámos a linha celular humana de neuroblastoma (SH-SY5Y) que sobre-expressava de forma condicionada a alfa-sin, i.e., de forma regulada por doxiciclina (Dox) através de um sistema Tet Off. Neste caso, correlacionámos a ocorrência de stresse oxidativo em células que sobre-expressam alfa-sin WT (-Dox) antes e após uma exposição curta a ferro. Os resultados evidenciaram a produção elevada de ROS em condições basais em células que sobre-expressavam alfa-sin WT, comparativamente às células que expressavam a proteína endógena (+Dox), sem no entanto se verificarem alterações na capacidade redutora das células e nos níveis de proteínas apoptóticas. Além disso, o aumento dos níveis de ROS foi estreitamente relacionado com uma diminuição das atividades e dos níveis de proteínas envolvidas nas vias de defesa antioxidante, nomeadamente da superóxido dismutase de tipo 1 (SOD1), da SOD2, do glutatião reduzido (GSH) e oxidado (GSSG), enquanto as enzimas do ciclo redox do glutatião permaneceram inalteradas. De acordo com estes dados, os níveis da subunidade catalítica da glutamato cisteína ligase (GCLc) revelaram-se diminuídos. A análise de frações nucleares demonstrou que o fator de transcrição Nrf2 (do inglês ‘nuclear factor Resumo 34 erythroid 2-related factor 2’), que ativa a transcrição dos genes destas enzimas antioxidantes após a formação de ROS intracelular, apresentava níveis mais baixos nas células –Dox. Por outro lado, o tratamento com ferro, embora tenha aumentado em grande medida a produção de ROS em ambas as células (+Dox e –Dox), induziu um aumento significativo dos níveis e atividades destas proteínas antioxidantes, aparentemente de uma forma independente da sobre-expressão da alfa-sin, sugerindo um mecanismo de defesa intrínseco e compensatório contra o estímulo oxidante. Na parte final do trabalho investigámos o papel da expressão de alfa-sin WT na disfunção mitocondrial, fortemente associado à patologia da PD. Utilizando o mesmo modelo celular em que a expressão da alfa-sin foi regulada por Dox, mostrámos que as células que sobreexpressam alfa-sin, continham grandes quantidades de alfa-sin na mitocôndria, revelaram níveis mais elevados de anião superóxido mitocondrial, que, no entanto, não foram exacerbados após o tratamento com ferro. De acordo com o aumento dos níveis de ROS na mitocôndria, a análise da medição da atividade enzimática do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial mostrou uma diminuição da atividade do mesmo, em conformidade com estudos anteriores que evidenciaram o papel da disfunção mitocondrial mediada por alfa-sin e a patogénese da PD. Além disso, não verificámos alterações dos níveis do fator de transcrição mitocondrial A (TFAM, do inglês ‘mitochondrial transcription factor A’), nem do PGC-1alfa (do inglês ‘peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha’) entre células +Dox e –Dox. Por outro lado, observámos uma redução da atividade da SOD1 em frações mitocondriais das células –Dox, que decresceu ainda mais após a exposição a ferro. Ao contrário da SOD1, a atividade da enzima SOD2 mitocondrial não se revelou alterada em condições basais nas células –Dox; contudo, observou-se um claro aumento da atividade da SOD2 após tratamento com ferro. As proteínas GSH e GSSG do ciclo do glutatião permaneceram diminuídas em frações mitocondriais das células –Dox em condições não tratadas, enquanto a exposição a ferro não afetou os níveis destes antioxidantes endógenos. Estes resultados mostram que a presença de altos níveis de alfasin na mitocôndria pode influenciar negativamente a atividade do complexo I mitocondrial Resumo 35 e promover a produção de ROS neste organelo, cujos níveis podem ser exacerbados devido a baixas defesas antioxidantes. Em conjunto, este estudo vem adicionar informação relevante sobre a existência de uma estreita relação entre a sobre-expressão da alfa-sin WT e mutante e modificações póstraducionais (e.g. fosforilação) destas proteínas e os mecanismos associados ao stresse oxidativo, incluindo as vias celulares e mitocondriais de defesas antioxidantes. Estes resultados revelam ainda a importância do desenvolvimento de estratégias neuroprotetoras direcionadas para a regulação do processo transcricional, com o objetivo de prevenir o desequilíbrio da homeostasia redox, que pode levar, subsequentemente, ao processo neurodegenerativo na PD.