Characterization of ecto-5’-nucleotidase (CD73) in the brain – role in adenosine A2A receptor activation

Abstract

A adenosina é um importante neuromodulador que participa em diferentes funções cerebrais e pode ser gerada extracelularmente por um mecanismo em cascata através de ectonucleotidases que desfosforilam ATP em adenosina. A ecto-5’-nucleotidase (CD73) é o enzima chave, participando no passo final de conversão do ATP extracelular em adenosina no cérebro. Neste estudo tirámos partido de um anticorpo selectivo para CD73 assim como de murganhos com delecção genética (knockout) de CD73 (CD73 KO), mostrando a sua elevada densidade no núcleo central da amígdala, no globus pallidus e no estriado; mostrámos ainda a sua presença no tubérculo olfactivo, nas meninges e no plexo coróide; e ainda, com níveis significativamente mais baixos, na substância nigra, no hipocampo e no córtex. Relativamente à sua distribuição celular mostrámos que a CD73 está presente nos astrócitos, mas está predominantemente localizada a nível pós-sináptico em todas as áreas cerebrais estudadas. O fenótipo dos murganhos CD73 KO foi estudado em contextos fisiológicos, tendo-se observado défices de coordenação motora e hiperlocomoção num campo aberto, mas não na gaiola, sem modificações comportamentais quando testados no labirinto em cruz elevado. Estes resultados sugerem que a CD73 melhora a coordenação motora, sem influenciar a locomoção e a ansiedade. Este fenótipo foi acompanhado de uma diminuição no estriado quer da fosforilação da DARPP-32 na treonina 75 quer da captação de aspartato, sem modificações da densidade dos receptores para a adenosina ou para a dopamina ou na imunoreactividade da encefalina. Os murganhos CD73 KO apresentaram ainda uma melhoria das memórias de trabalho e reconhecimento e da aprendizagem do acto de evitar, assim como uma ausência da sensitização induzida por anfetamina, uma diminuição na actividade psicomotora induzida por MK-801 e na neurodegeneração induzida por 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Deste modo este estudo aponta a CD73 como um possível alvo terapêutico para manipulação da coordenação motora e funções cognitivas, assim como em disfunções estriatais como as que ocorrem na viciação em drogas de abuso ou na esquizofrenia e na neurodegeneração que acontece na doença de Parkinson. De modo a explorar a participação da CD73 como fonte específica da adenosina que activa os receptores A2A para a adenosina (A2AR) estriatais, começámos por mostrar que a CD73 se co-localiza e co-imunoprecipita com os A2AR no estriado, e é positivo no ensaio de ligação próxima com os A2AR. De acordo com estes resultados, a formação de cAMP em sinaptosomas estriatais, assim como a hiperlocomoção induzida por uma nova prodroga que requer a metabolização por CD73 para activar os A2AR, foi observada nos murganhos de estirpe selvagem, mas não nos murganhos CD73 KO ou A2AR KO. Estes resultados sugerem que a formação de adenosina mediada pela CD73 poderá ser responsável pela activação dos A2AR estriatais. Consequentemente, este estudo aponta a CD73 como um novo alvo que pode ajustar a actividade dos A2AR estriatais, sendo um possível alvo terapêutico para manipular as funções de controlo estriatal e a neurodegeneração mediados pelos A2AR. Sendo a adenosina um anticonvulsante endógeno, explorámos a participação da CD73 como fonte de adenosina activando os A2AR para controlar a progressão desta patologia. Os murganhos CD73 KO exibem um perfil de convulsão inalterado, mas apresentam uma diminuição da perda neuronal. Além disso, a deleção selectiva dos A2AR nos neurónios (Fb A2AR KO) resulta num perfil anticonvulsivo e neuroprotector, enquanto que a deleção selectiva dos A2AR nos astrócitos (Gfa2 A2AR KO) resulta num fenótipo oposto, proconvulsivo e neurotóxico. Os resultados sugerem que uma disfunção na captação de glutamato causada pela deleção dos A2AR está na base dos diferentes padrões fenotípicos, implicando uma acção coordenada dos A2AR nos astrócitos e nos neurónios para controlar a transmissão glutamatérgica que estará perturbada em epilepsia. Devido ao rápido aumento dos A2AR a nível pré-sináptico no hipocampo após diferentes tipos de estimulação, explorámos a sua possível síntese local; tendo-se mostrado a presença do mRNA para os A2AR e a sua síntese local nos terminais pré-sinápticos do hipocampo. Explorámos ainda a participação específica dos A2AR no hipocampo em comportamentos de memória e aprendizagem. Tirando partido de murganhos com redução selectiva dos A2AR no hipocampo, através da injecção local de um vector que expressa Cre em murganhos que têm um exão importante de Adora2a flanqueado por loxP, mostrámos que os A2AR do hipocampo não participam na aprendizagem motora ou na ansiedade (em contraste com os murganhos com deleção dos A2AR nos neurónios de todo o prosencéfalo (Fb A2AR KO)), mas apresentam uma melhoria da memória de trabalho (em semelhança com o fenótipo dos murganhos Fb A2AR KO), assim como um défice do medo condicionado pelo contexto (mas não pelo som). Em conclusão, o trabalho aqui apresentado sugere a contribuição da adenosina derivada do enzima CD73 na activação dos A2AR estriatais, participando na coordenação motora, memória de trabalho, viciação em drogas de abuso, actividade psicomotora e neurodegeneração associada à doença de Parkinson. Para além disso, a adenosina derivada da CD73 parece participar na activação dos A2AR do hipocampo, cuja função se apresenta mais complexa do que anteriormente avaliado. Os nossos dados sugerem funções opostas dos A2AR do hipocampo nos neurónios versus nos astrócitos, no controlo da transmissão glutamatérgica com implicações para a epilepsia assim como a sua participação em processos cognitivos. Surpreendentemente, concluímos ainda que a síntese dos A2AR do hipocampo nos terminais pré-sinápticos está impelido a uma rápida e local regulação de modo a permitir modificações rápidas do ambiente sináptico.

Adenosine is an important neuromodulator that participates in different brain functions and can be extracellularly generated by an ectonucleotidase cascade that is able to catabolize ATP into adenosine. Ecto-5’-nucleotidase (CD73) catabolizes the final step of conversion of extracellular ATP into adenosine in the brain. Since the brain distribution of CD73 is still unclear, we here took advantage of a selective antibody against CD73 and of CD73 knockout (KO) mice to unveil the brain distribution of CD73, showing that it is highly expressed in the central nucleus of the amygdala, globus pallidus and striatum. CD73 is also present in the olfactory tubercle, meninges and choroid plexus and is also present at lower levels in the substantia nigra, hippocampus and cortex. Regarding the cellular and subcellular distribution of CD73 we here showed that, in addition to astrocytes, CD73 is prominently localized in postsynaptic sites in all the brain areas studied (cortex, hippocampus and striatum). The phenotype of CD73 KO mice in physiological conditions suggest that CD73 is responsible for an improved motor coordination, without affecting locomotion or anxiety. This phenotype was accompanied by a lower phosphorylation of DARPP-32 at threonine 75 and a decreased D-aspartate uptake in the striatum, without modifications of adenosine or dopamine receptors levels or enkephalin immunoreactivity. Moreover, CD73 KO mice displayed improved working and recognition memories and avoidance learning. In addition we demonstrated the participation of CD73 in amphetamine-induced sensitization, MK-801-induced psychomotor activity and in MPTP-induced neurodegeneration. These findings suggest that CD73 can be a possible therapeutic target in brain dysfunctions characterized by altered motor coordination and cognitive functions and potential neurodegeneration, as well as neuropsychiatric disorders (e.g. drug addiction and schizophrenia). Adenosine is a neuromodulator that acts mainly through inhibitory A1 receptors (A1R) and facilitatory A2AR, which have similar affinities for adenosine. In order to explore the participation of CD73 in the specific source of adenosine activating striatal A2AR, we first showed that CD73 is closely associated with A2AR in the basal ganglia, as gauged by the co-localization, co-immunoprecipitation and positive proximity ligation assays between these two proteins. Accordingly, both the hypolocomotion and the cAMP formation in striatal synaptosomes induced by a novel A2AR prodrug that requires CD73 metabolization to activate A2AR, were observed in wild type mice, but not in CD73 KO or A2AR KO mice. These results show that CD73-mediated formation of extracellular adenosine is responsible for the activation of striatal A2AR function. These findings suggest CD73 as a new target to fine-tune striatal A2AR activity, and therefore as a novel therapeutic target to manipulate A2AR-mediated control of striatal function and neurodegeneration. Since adenosine acting via A1R is widely recognized as an endogenous anticonvulsant, we next explored the participation of CD73 as the molecular source of adenosine and the relevance of A2AR in the progression of epilepsy. CD73 KO mice exhibited an unaltered convulsive profile, albeit with a decreased hippocampal neuronal loss. In addition, mice with selective deletions on either neuronal or astrocytic A2AR, displayed an opposite phenotype, with an anticonvulsive and neuroprotective profile observed for neuronal A2AR KO and a proconvulsive and neurotoxic profile for astrocytic A2AR KO. Notably, our data also suggest that a dysfunctional glutamate uptake caused by A2AR deletion might be at the basis of the different phenotypic patterns and imply a differential and delicate coordinated action between astrocytic A2AR and neuronal A2AR to fine-tune glutamatergic transmission that is disrupted in epilepsy. Due to the participation of A2AR in noxious hippocampal conditions and in cognitive functions we investigated the role of this particular pool of A2AR. Owing to the hippocampal increased of presynaptic A2AR after different types of stimulation, we explored its possible local synthesis. We showed the presence of A2AR mRNA and its local synthesis in presynaptic nerve terminals of the hippocampus. Moreover, we explored the specific participation of hippocampal A2AR in learning and memory behaviors. Taking advantage of hippocampal A2AR knockdown mice, generated by injection into the dorsal hippocampus of a vector that expresses Cre in A2AR-floxed mice, we further demonstrated that hippocampal A2AR do not participate in motor learning or anxiety (in contrast to forebrain (Fb) A2AR KO), but showed improved working memory (in similarity with Fb A2AR KO phenotype) and impaired context (but not tone) fear conditioning. In conclusion, our work suggests that CD73-derived adenosine is involved in striatal A2AR activation, thus participating on the control of a vast number of functions such as motor coordination, working memory, drug addition, psychomotor activity and neurodegeneration associated with Parkinson’s disease. In addition, CD73-derived adenosine seems to participate in hippocampal A2AR activation. Moreover, our data suggest opposite functions of neuronal and astrocytic hippocampal A2AR in the control of glutamatergic transmission with implications for epilepsy. Finally, we demonstrated that hippocampal A2AR synthesis at presynaptic nerve terminals is prompt to a rapid and local regulation in order to quickly change the synaptic environment and thus impacting on cognition. The complete understanding of CD73 physiology and mediation of A2AR activation may lead to the future development of strategies for modulating A2AR function in the treatment of different brain disorders.