Regulation of heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein K (hnRNP K) by BDNF : changes in mRNA binding as determined by microarray analysis

Abstract

Neurons are highly polarized cells, and the local synthesis of proteins at the synapse requires mechanisms to deliver specific transcripts to dendrites. The transport of newly synthesized mRNAs from the nucleus to dendrites is conducted by RNA granules that allow the delivery and stabilize transcripts. These granules are disassembled in response to synaptic stimulation and this is thought to release the mRNAs for subsequent local protein synthesis. Local protein synthesis at the synapse is particularly important for the maintenance of LTP (long-term potentiation), a wellknown form of synaptic plasticity that is thought to underlie learning and memory processes. The interaction with different proteins is thought to provide specificity in the delivery and transport of mRNAs to dendrites. Furthermore, since local translation at the synapse is induced by synaptic activity, the interaction of RNA binding proteins and the transcripts is likely to be regulated by intracellular signaling mechanisms. In this work, we aimed at characterizing the mRNAs associated with the RNA binding protein hnRNP K in cultured hippocampal neurons, a protein present at the synapse, and the regulation by the neurotrophin BDNF (brain-derived neurotrophic factor). BDNF plays an important role in the late phase of LTP, which is dependent on protein synthesis. Furthermore, we investigated whether hnRNP K is phosphorylated in response to stimulation of hippocampal neurons with BDNF. hnRNP K was immunoprecipitated from cultured hippocampal neurons, stimulated or not with BDNF (10 min), and the transcripts present in the immunoprecipitates were identified by microarray analysis. A total of 11422 transcripts were identified in hnRNP K immunoprecipitates from cultured hippocampal neurons under resting conditions. Gene Ontology analysis showed that ABSTRACT 2 these mRNAs code for proteins involved in cellular processes, metabolic processes, biological regulation and cellular signaling, among others. The interaction of about 50 % of these transcripts was sensitive to stimulation of hippocampal neurons with BDNF, and in most cases (99.9 %) the neurotrophin decreased the amount of mRNAs coimmunoprecipitated with hnRNP K. The results obtained for 4 transcripts coding for synaptic proteins (GluA1, GluA2, GluN1, and CaMKIIβ), as well as for BDNF and its TrkB receptor, were validated by real-time PCR. The decrease in transcript coimmunoprecipitation with hnRNP K was correlated with an increase in the phosphorylation of the protein on Ser302 in hippocampal neurons stimulated with BDNF Taken together the results obtained allowed identifying a large group of mRNAs that are associated (directly or indirectly) with hnRNP K in cultured hippocampal neurons, and may be transported to dendrites by this RNA binding protein. Also, the observed BDNF-induced phosphorylation of hnRNP K may change the RNA-protein interaction since a significant fraction of the mRNAs were dissociated after stimulation of hippocampal neurons with the neurotrophin. These evidences support the role of BDNF on the late phase of LTP since we clearly showed that it promotes the release of the transported mRNAs associated with hnRNP K, which should allow them to be locally translated.

Os neurónios são células altamente polarizadas, e a síntese local de proteínas na sinapse requer mecanismos para o endereçamento de transcritos específicos para as dendrites. O transporte de mRNAs recém-sintetizados desde o núcleo até às dendrites é feito por grânulos de RNA que permitem a entrega e estabilização dos transcritos. Estes grânulos são desorganizados em resposta à estimulação sináptica, permitindo possivelmente a libertação dos mRNAs e subsequente síntese proteica local. A síntese de proteínas na sinapse é particularmente importante para a manutenção da LTP (potenciação sináptica de longa duração), uma forma bem conhecida de plasticidade sináptica que se pensa estar na base dos processos de aprendizagem e memória. A interacção dos diferentes transcritos com proteínas distintas é provavelmente responsável pela especificidade no endereçamento e no transporte de mRNAs para as dendrites. Além disso, uma vez que a síntese proteica local na sinapse é induzida pela actividade sináptica, a interacção entre as proteínas que ligam RNA e os transcritos deverá sofrer regulação por mecanismos de sinalização intracelular. Neste trabalho, caracterizámos os mRNAs associados à hnRNP K, uma proteína presente na sinapse e com capacidade para ligar RNA, em culturas de neurónios de hipocampo. Comparou-se a população de transcritos que interage com a hnRNP K em condições de repouso e em células estimuladas com a neurotrofina BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro). O BDNF desempenha um papel importante na fase tardia do LTP, que é dependente de síntese proteica. Além disso, investigámos a fosforilação da hnRNP K em resposta à estimulação dos neurónios de hipocampo com BDNF. A hnRNP K foi imunoprecipitada a partir de culturas de neurónios de hipocampo, estimuladas ou não com BDNF (10 min), e os transcritos presentes nos imunoprecipitados foram RESUMO 4 identificados por análise de microarray. Foram identificados 11422 transcritos nos imunoprecipitados de hnRNP K obtidos a partir de neurónios do hipocampo em cultura em condições de repouso. A análise através do Gene Ontology revelou que estes mRNAs codificam proteínas envolvidas em processos celulares, metabolismo, regulação celular, e sinalização celular, entre outras funções. A interacção de cerca de metade destes mRNAs foi afectada pela estimulação dos neurónios com BDNF, tendose observado uma redução na co-imunoprecipitação com a proteína hnRNP K em cerca de 99.9 % dos casos. Os resultados obtidos para 4 transcritos que codificam proteínas sinápticas (GluA1, GluA2, GluN1 e CaMKIIβ), bem como para o BDNF e o seu receptor TrkB, foram validados por PCR em tempo real. A diminuição na coimunoprecipitação de transcritos com a hnRNP K foi correlacionada com um aumento na fosforilação da proteína na Ser 302 em neurónios de hipocampo estimulados com BDNF. No conjunto, os resultados obtidos permitiram identificar um grande grupo de mRNAs que estão associados (directa ou indirectamente) com a hnRNP K em culturas de neurónios de hipocampo. Estudos adicionais são necessários para investigar o papel da hnRNP K no transporte destes mRNAs para as dendrites. Além disso, a fosforilação da hnRNP K induzida pelo BDNF poderá afectar a interacção proteína-RNA uma vez que uma fracção significativa dos transcritos deixou de co-imunoprecipitar com a hnRNP K após a estimulação dos neurónios de hipocampo com a neurotrofina. Estas evidências reforçam o papel do BDNF na fase tardia do LTP, uma vez que mostram claramente que este promove a libertação dos mRNAs transportados associados à hnRNP K, o que deverá contribuir para a síntese local de proteínas.