Investigação do mtDNA nas doenças de Huntington e Parkinson

Abstract

As doenças de Huntington (DH) e Parkinson (DP) são duas patologias neurodegenerativas que têm sido alvo de inúmeros estudos nos últimos anos. A DH é uma doença autossómica dominante causada pela expansão de uma repetição do trinucleótido CAG no gene IT15 ou HD, que codifica a proteína huntingtina (Htt). Caracteriza-se por uma atrofia do núcleo caudado e do putamen. Por sua vez, a DP caracteriza-se principalmente por uma perda dos neurónios dopaminérgicos localizados na substância nigra, sendo cerca de 5% dos casos hereditários. Estes estão associados a mutações em genes que codificam proteínas, nomeadamente a alfa-sinucleína. A DH pode estar relacionada com vários mecanismos patogénicos, com destaque para o envolvimento da mitocôndria, nomeadamente no que se refere ao stress oxidativo, comprometimento no transporte de cálcio, disfunção metabólica, entre outros. Neste sentido, torna-se importante o estudo do mtDNA, que desempenha um papel importante em diversas doenças neurodegenerativas. Os cíbridos tornaram-se uma abordagem útil no estudo de defeitos causados por mutações a nível do mtDNA, nomeadamente na DH. Porém, para atingir este objetivo é necessário, em primeiro lugar, obter células Rho-0. Desta forma, é essencial a confirmação de uma depleção total de mtDNA nestas células. Neste trabalho, pretendeuse alcançar esse objetivo através da quantificação do número de cópias de mtDNA, em controlos e doente de Huntington, através de PCR em tempo real. Na DP, também também existem inúmeras evidências de envolvimento da mitocôndria nos mecanismos etiopatogénicos que levam à doença. Foi reconhecido que a alfa-sinucleína desempenha um papel crucial nesta doença, ocorrendo interação com a mitocôndria, que pode ser importante nos mecanismos subjacentes à doença. Assim, com o fim de tentar compreender uma possível relação entre o mtDNA e a expressão desta proteína, recorreu-se a um sistema Tet-off, do qual resulta uma expressão normal ou sobre-expressão da alfa-sinucleína. Para esta análise procedeu-se à medição do número de cópias de mtDNA em células que expressavam a proteína em questão nas condições referidas. No sentido de investigar alterações no mtDNA, foi também objectivo proceder à sequenciação do mtDNA, em particular dos sete genes mitocondriais MT-ND, que codificam subunidades do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial. Na quantificação do número de cópias em células Rho-0, não se observou uma depleção total do mtDNA. Pelo contrário, detetou-se um número elevado de cópias, quer nas células controlo, quer nas células de doente. Foram usadas células expostas a 0, 50 e 75 ng/mL de brometo de etídeo (BrEt). Verificou-se uma diferença estatisticamente significativa entre as concentrações de 0 e 50 ng/mL e entre 0 e 75 ng/mL, para as células controlo. Nas concentrações usadas de BrEt nas células de doente, não se observaram diferenças estatisticamente significativas. Relativamente ao número de cópias para as condições +Dox e -Dox das células de DP, também não se verificou uma diferença estatisticamente significativa. Já no que toca à sequenciação dos genes MT-ND nestas células, foi detetada a alteração 11016 G>A para ambas as condições, não tendo sido detetadas variações devidas à alfa-sinucleína. Este trabalho permitiu entender que a PCR em tempo real poderá ser utilizada como alternativa a um conjunto de técnicas utilizadas em diversos estudos no sentido de averiguar a depleção total de mtDNA, visto ser mais simples e rápido. Apesar de a alteração detetada se tratar de um polimorfismo, de ter sido encontrada nas duas condições e de não parecer existir uma relação entre o número de cópias nestas condições, não se pode descartar a possível relação do mtDNA com a alfa-sinucleína na DP. Estudos anteriores mostraram uma associação entre alterações no mtDNA e a DP, tendo-se também observado que a inibição da atividade do complexo I poderá conduzir à agregação da proteína.

Huntington disease (HD) and Parkinson's disease (PD) are two neurodegenerative disorders that have been the subject of numerous studies in the recent years. HD is an autosomal dominant disease caused by expansion of a trinucleotide CAG repeat in the IT15 gene or HD, encoding the protein huntingtin (Htt). It’s characterized by atrophy of the caudate nucleus and putamen. In turn, PD is characterized mainly by a loss of dopaminergic neurons located in the substantia nigra, and 5% of the cases are familial. These are associated with mutations in genes encoding proteins, in particular alpha-synuclein. HD may be related to a wide variety of pathogenic mechanisms, with emphasis on mitochondria, in particular in relation to oxidative stress, impairment in calcium transport, metabolic dysfunction, among others. Accordingly, it is important to study the mtDNA, which plays an important role in several neurodegenerative diseases. Cybrids became a useful approach in the study of defects caused by mutations of mtDNA levels, particularly in HD. However, to achieve this goal it is first necessary to obtain Rho-0 cells. Thus, it is essential to confirm a total depletion of mtDNA in these cells. In this work we intended to achieve this objective by quantifying the number of copies of mtDNA in controls and Huntington patients, by real-time PCR. With regard to PD, there’s also evidence of a correlation with the mitochondria in the etiopathogenic mechanisms that lead to the disease. It was recognized that alpha-synuclein plays a crucial role in this disease, occuring interaction with mitochondria, which can be important in the mechanisms related to PD. Thus, in order to try to understand the interactions between the mtDNA and the expression of this, we used a Tet-off system, which results in a regular expression or over-expression of alpha-synuclein. For this analysis we carried out the measurement of mtDNA copy number in cells expressing the protein in question as indicated. In order to investigate changes in the mtDNA we also proceeded to mtDNA automated sequencing, in particular of the seven mitochondrial genes MT-ND., which encode subunits of complex I of the mitochondrial respiratory chain. In mtDNA copy number quantification of Rho-0 cells, there was not a total mtDNA depletion. On the opposite, it was quantified a high number of copies, either in control cells or patient cells. We used cells exposed to 0, 50 and 75 ng/mL of ethidium bromide. There was a statistically significant difference between the concentrations from 0 to 50 ng/mL and between 0 and 75 ng/mL, for the control cells. For the used ethidium bromide concentrations in patient cells, there were no statistically significant differences. For the copy number to the +Dox and -Dox conditions PD cells, there was also no statistically significant difference. In what regards the sequencing of the MTND genes in these cells it was detected the variation 11016 G> A for both conditions, and no variations due to alpha-synuclein were detected. This work allowed us to understand that real-time PCR can be used as an alternative to a set of techniques used in several studies to determine the total depletion of mtDNA, since it is simpler and faster. Despite the variation detected is a polymorphism, found in both conditions and that did not seem to exist a relationship between the number of copies and the two studied conditions, it can’t be excluded the possible relationship of mtDNA with alphasynuclein in PD. Previous studies have shown an association between the mtDNA and mtDNA PD sequence variations and it was also observed that the inhibition of the activity of complex I may lead to protein aggregation.