Quantificação de astaxantina e α-tocoferol em lagostim Procambarus clarkii e seus subprodutos por UHPLC-DAD e determinação da sua actividade antioxidante

Abstract

O lagostim vermelho Procambarus clarkii é nativo da região centro-sul dos EUA e do nordeste do México. Este crustáceo possui várias características que fazem dele uma espécie com grande carácter invasivo, devido a características de reprodução (taxa de crescimento elevada, alta fecundidade, maturidade precoce, várias gerações num ano), bem como características de plasticidade ecológica (tolerância a diversas condições ambientais e a diversos recursos alimentares). A orizicultura tem sofrido sérios danos com o aparecimento desta espécie invasora, visto que o seu comportamento escavatório provoca a destruição de diques e fugas de água nos arrozais, assim como, dificulta a sobrevivência dos rebentos de arroz. Contudo, é importante estudar a composição desta matriz no que diz respeito aos seus compostos bioactivos, com potenciais beneficios para a saúde, nomeadamente o seu conteúdo em astaxantina, por forma a encontrar aplicações na indústria alimentar, cosmética e farmacêutica. A astaxantina é o carotenóide predominante em crustáceos da ordem Decapoda, sendo um dos antioxidantes naturais mais poderosos e economicamente valiosos devido às suas funções biológicas. O objectivo deste trabalho foi determinar o teor da astaxantina e do α-tocoferol no lagostim P. clarkii inteiro e seus subprodutos, cru e cozido, por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC) acoplada ao detector de diodos (DAD) e comparar a actividade antioxidante in vitro do lagostim P. clarkii, camarão selvagem e de aquacultura (Penaeus sp.), através de ensaios do radical DPPH• e do radical ABTS•+ expresso em TEAC (Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox®). Na determinação da capacidade antioxidante in vitro, pelos dois métodos verificou-se que o camarão selvagem foi a amostra com maior actividade antioxidante, seguido-se o camarão de aquacultura e o lagostim P. clarkii. Contudo, pelo método ABTS obtiveram-se melhores resultados de actividade antioxidante para todos os extractos comparativamente ao método DPPH. Uma das possíveis causas é a interferência do espectro de absorção dos carotenóides com o do radical DPPH• a 517 nm. Relativamente à metodologia aplicada na quantificação dos analitos, além do lagostim inteiro, foram analisados individualmente o cefalotórax, o exoesqueleto e a parte edível, antes e após cozedura. As amostras (0,25g) foram extraídas com 5 mL de metanol. A separação cromatográfica foi obtida usando uma pré-coluna (UPLC® BEH, 2,1 x 5 mm, Resumo iii partículas de 1,7 μm) e uma coluna (UPLC® BEH, 2,1x50 mm, partículas de 1,7 μm) a 20 °C. A detecção da astaxantina e do α-tocoferol foi monitorizada a 480 nm e a 294 nm, respectivamente. A fase móvel utilizada foi um gradiente de fase móvel A [diclorometano/metanol com 0,05 M de acetato de amónio /acetonitrilo 5:20:75 (v/v/v)] e de fase móvel B (água ultrapura), com um fluxo de 0,5 mL/min. O volume de injecção foi de 10 μL. O método usado para determinar a astaxantina e o α-tocoferol provou ser simples, rápido, selectivo e permitiu uma boa resolução a baixos níveis de detecção. Apresentou um limite de quantificação (LQ) de 0,05 μg/mL para a astaxantina e de 0,6 μg/mL para o α-tocoferol. Obtiveram-se boas linearidades para os dois analitos, nomeadamente, um coeficiente de determinação (r2) de 0,9991 para a astaxantina e de 0,9994 para o α-tocoferol. O processo de extracção da astaxantina apresentou bons resultados de recuperação nos níveis de concentração estudados, nomeadamente de 97% ± 6% no exoesqueleto cozido, 99% ± 7% no cefalotórax cozido e 89% ± 7,2% no lagostim inteiro cozido. Relativamente à precisão intra-dia, obteve-se valores de (RSD%) ≤ 5% para a astaxantina e para o α-tocoferol (n=3). No caso do α-tocoferol, obteve-se um RSD (%) ≤ 10 para a precisão inter-dia, nas amostras cruas (n=9). Em ambos os tipos de amostra (cru e cozido), o exoesqueleto obteve a concentração de astaxantina mais elevada, seguido do cefalotórax e da parte edível. As amostras de exoesqueleto cozidas evidenciaram uma coloração mais intensa (30,5 ±1,2 de astaxantina/g), pois o aumento da temperatura provoca a desnaturação das carotenoproteinas levando à libertação da astaxantina. No caso do α-tocoferol, o cefalotórax foi o componente com maior concentração (58,6 ± 1,6 μg/g). Sendo que, o processo de cozedura provocou uma diminuição considerável na concentração de α-tocoferol em todas as amostras. Dos resultados obtidos pode ser concluído que o lagostim invasor Procambarus clarkii pode ser considerados uma boa fonte natural de astaxantina, sendo um poderoso antioxidante, com inúmeras aplicações na tecnologia alimentar e na nutrição humana e animal

The red crayfish Procambarus clarkii is native to the south-central USA and north-eastern Mexico. This crustacean has several characteristics that make it an invasive species due to reproduction characteristics (high growth rate, high fecundity, early maturity, several generations in a year), as well as ecological plasticity characteristics (tolerance to different environmental conditions and several resources food). The rice production has suffered serious damage with the appearance of this invasive species, because of their excavatory behavior resulting in destruction of levees and loss of water from fields, as well as hinders the survival of the rice shoots. However, it is important to study its composition, namely in bioactive compounds, with potential human health benefits, in particular astaxanthin content, to find possible profit applications for the food, cosmetics and pharmaceutical industries. Astaxanthin is the predominant carotenoid in crustaceans of the order Decapoda, one of the most powerful natural antioxidant and economically valuable because of their biological functions. The aim of the present work was to determine the astaxanthin and α-tocopherol content of crayfish P. clarkii and its by-products, raw and cooked, by Ultra High performance Liquid Chromatography (UHPLC) coupled with diode array detection (DAD). Compare antioxidant activity in vitro in the crayfish P. clarkii, wild and farmed shrimp (Penaeus sp.) by DPPH• radical scavenging activity and ABTS•+ radical scavenging activity (Trolox® equivalence antioxidant capacity) assays. All the analyzed samples revealed antioxidant activity by the two methods, but wild shrimp showed the highest antioxidant activity, followed farmed shrimp and crayfish P.clarkii. However, antioxidative compounds in all extracts are shown to scavenge ABTS•+ radical at higher level compared to DPPH• radical, one possible cause is the absorption spectrum interference of carotenoids with the DPPH at 517 nm. Regarding the methodology applied for the quantification of analytes, besides the whole crayfish, head, exoskeleton and meat have also been analysed, before and after boiling. Samples (0.25g) were extracted with 5 mL of methanol. The chromatographic separation was achieved using a vanguard pre-column (UPLC® BEH, 2.1 x 5 mm, 1.7 μm particle size) and a column (UPLC® BEH, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm particle size) at 20 °C. Astaxanthin and α- tocopherol detection was monitored at 480 nm and 294 nm, respectively. The mobile phase is a gradient of mobile phase A [dichoromethane/methanol with 0.05 M ammonium acetate Abstract v /acetonitrile 5:20:75 (v/v)] and mobile phase B (ultrapure water) with a flow rate of 0.5 mL/min. A volume of 10 μL was injected into the UHPLC. The method used to determine the astaxanthin and α-tocopherol proved to be simple, rapid, selective and allows good resolution at low detection levels. The method presented a limit of quantification (LQ) of 0.05 μg / mL for astaxanthin and 0.6 μg / mL for α-tocopherol. Linearity was good for both analytes, namely a coefficient of determination (r2) of 0.9991 for astaxanthin and 0.9994 for α-tocopherol. The extraction process of astaxanthin showed good recovery results for the concentration levels studied, namely 97% ± 6% for cooked exoskeleton, 99% ± 7% for cooked cephalothorax and 89% ± 7.2% for cooked whole crayfish. Regarding the intra-assay precision, the relative standard deviation (RSD %) value was ≤ 5% for the astaxanthin and α-tocopherol (n=3). For the α-tocopherol the relative standard deviation (RSD %) value of intra-assay was ≤ 10 %, in raw samples (n=9). In both types of samples (raw and cooked crayfish), the exoskeleton had the highest concentration of astaxanthin, followed by the head and then, by far, by the crayfish meat. The cooked exoskeleton samples showed a more intense red coloration (30.5 ±1.2 μg astaxanthin/g), caused by the release of astaxanthin from the carotenoproteins by denaturation due to increased temperature. In the case of α-tocopherol, the carapace was the component with the highest concentration (58.6 ± 1.6 mg / g). The cooking process caused a considerable decrease of α-tocopherol concentration in all samples. These results suggest that invasive crayfish Procambarus clarkii can be considered a good natural source of astaxanthin, which is a potent antioxidant with a variety of applications in food technology and human/animal nutrition.