Cellular and molecular mechanisms of impaired wound healing in diabetes : understanding the role of substance P and mast cells

Abstract

Diabetes mellitus (DM) é uma das doenças crónicas mais predominantes no Mundo, representando um grave problema de saúde pública. Uma das complicações mais debilitantes e dispendiosas da DM consiste no desenvolvimento de úlceras crónicas, não cicatrizantes, do pé diabético (DFU). Apesar dos esforços para desenvolver novos tratamentos, as terapias actualmente disponíveis são escassas e de eficácia limitada. Assim, compreender as vias complexas e multifactoriais conducentes à cicatrização deficitária de feridas diabéticas (DM) é crucial para identificar novas estratégias terapêuticas para DFU. A neuropatia diabética periférica (DPN), doença vascular periférica (PVD), reduzida resistência a infecção e anomalias bioquímicas são os principais factores de risco para o desenvolvimento de DFU. Além disso, a inflamação sistémica relacionada com DM e a deficiência em neuropeptídeos associada à DPN, foram recentemente propostos como contribuintes importantes para o insucesso na cicatrização. No entanto, a investigação translacional dos mecanismos subjacentes à fisiopatologia da DFU é escassa. Os principais objectivos desta tese são identificar os mecanismos celulares e moleculares através dos quais a inflamação crónica e a deficiência em neuropeptídeos comprometem a cicatrização na DM, e desenvolver novas estratégias que os consigam reverter e restaurar o processo de cicatrização. Para avaliar se o ambiente pro-inflamatório crónico observado sistemicamente na DM está presente ao nível da pele, analisou-se a inflamação em biópsias de pele de pacientes diabéticos (DM) e vários modelos animais DM, e dos seus respectivos controlos não diabéticos (non-DM). Observou-se não só um aumento da inflamação, como também da densidade de vasos sanguíneos, confirmada por marcação específica, nas biópsias de todos os grupos DM. Estes resultados indicam claramente um estado pro-inflamatório na pele DM. Neuropeptídeos segregados pelas pequenas fibras nervosas periféricas participam na cicatrização de feridas. O neuropeptídeo Substância P (SP) revelou promover a cicatrização de feridas em córneas non-DM e DM, e em feridas cutâneas non-DM. No entanto, os seus efeitos e mecanismos de acção em feridas da pele DM continuam por esclarecer. Assim, o efeito do tratamento local com SP, bem como o impacto da deficiência em SP ou no seu receptor foram estudados. Os principais resultados revelaram que a SP melhora a cicatrização de feridas DM ao promover a resposta inflamatória nas fases iniciais da cicatrização e resolver a inflamação nas fases mais avançadas, permitindo a progressão para a etapa proliferativa. Contrariamente, a deficiência em SP demonstrou estar relacionada com a inflamação crónica e o insucesso na cicatrização que ocorrem na DM. Além disso, os níveis de SP estavam reduzidos na pele de pacientes e ratinhos DM, enquanto que a expressão local da enzima que degrada a SP, neutral endopeptidase (NEP), estava aumentada. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento de estratégias de protecção e entrega local de SP às feridas poderá ser benéfico para o tratamento de DFU. Os mastócitos (MC) da pele estão localizados perto de terminações nervosas e podem ser estimulados por neuropeptídeos, nomeadamente SP. Além disso, estão envolvidos em todas as fases da reparação de feridas. No entanto, existe pouca informação sobre a função dos MC na pele DM e sobre a sua participação na cicatrização anormal na DM. Para investigar este assunto, avaliaram-se os MC na pele de pacientes e ratinhos DM. A pele DM mostrou maior desgranulação dos MC associada a inflamação sistémica e local. Observou-se desgranulação dos MC pós-ferida apenas nos ratinhos não-DM, enquanto que a estabilização dos MC reverteu este efeito e melhorou a cicatrização nos DM. Além disso, ratinhos com défice em MC, com ou sem DM, revelaram cicatrização anómala. Estes resultados indicam que a presença de MC intactos na pele e a sua desgranulação pós-ferida são cruciais para uma cicatrização óptima, enquanto que a desgranulação dos MC pré-ferida apresenta efeitos semelhantes à ausência de MC. Estes resultados sugerem a estabilização dos MC como um potencial candidato a novas terapias para DFU. Por fim, novos biomateriais que oferecem uma entrega direccionada e controlada de múltiplos efectores envolvidos na cicatrização de feridas, nomeadamente neuropeptídeos e precursores de células endoteliais (EC), foram testados em modelos experimentais de cicatrização de feridas DM com resultados promissores, enfatizando o potencial terapêutico destes bioprodutos no tratamento de DFU. Resumindo, os resultados apresentados nesta tese esclarecem os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na cicatrização deficitária de feridas DM e sugerem novas estratégias terapêuticas para DFU com elevado potencial translacional. Estudos futuros serão necessários para validar estes resultados noutros modelos pré-clínicos e optimizar as terapias.

Diabetes mellitus (DM) is one of the most predominant chronic diseases worldwide, representing a serious problem of public health. One of the most debilitating and costly complications of DM is the development of chronic, non-healing diabetic foot ulcers (DFU). Despite the efforts to develop new treatments for DFU, the currently available therapies are scarce and their efficacy limited. Therefore, understanding the complex multifactorial pathways that lead to DM-impaired wound healing is crucial in order to identify novel therapies for DFU. Diabetic peripheral neuropathy (DPN), peripheral vascular disease (PVD), reduced resistance to infection, and biochemical abnormalities are major risk factors for DFU development. In addition, DM-related systemic inflammation and DPN-associated lack of neuropeptides have recently been suggested as important contributors to DFU failure to heal. However, there has been very little clinically driven basic research into the mechanisms underlying the pathophysiology of DFU. The main objectives of this thesis are to identify the cellular and molecular mechanisms through which chronic inflammation and neuropeptide deficiency lead to wound healing failure in DM, and to develop new strategies that can reverse them, thus restoring the healing process. To evaluate whether the chronic pro-inflammatory environment observed systemically in DM was present at the skin level, skin biopsies from diabetic (DM) patients and several DM animal models, together with their respective non-diabetic (non-DM) controls, were assessed for inflammation. The results showed not only increased inflammation, but also increased blood vessel density - confirmed by a specific marker - in the skin biopsies from all DM groups. These findings clearly indicate a pro-inflammatory state in DM skin. Neuropeptides secreted by peripheral small nerve fibers participate in wound healing. The neuropeptide Substance P (SP) has been shown to promote healing in non-DM and DM corneal injuries and in non-DM cutaneous wounds. However, little is known regarding its effect and mechanisms of action in DM skin wounds. Therefore, the effect of local SP treatment as well as the impact of SP or SP receptor deficiency were studied. The main findings were that SP improves DM wound healing mainly by promoting the acute inflammatory response at the early stages of healing and resolving inflammation at the later stages, thereby enabling progression to the proliferative phase. Conversely, SP deficiency was found to be associated with the chronic inflammation and healing failure that occur in DM. Additionally, SP levels were reduced in the skin of both DM human subjects and mice, whereas the local expression of the enzyme that digests SP - neutral endopeptidase (NEP) - was elevated. This work suggests that developing strategies to protect and locally deliver SP to the wound could be extremely beneficial for DFU treatment. Skin mast cells (MC) are located in close proximity to nerve endings and can be stimulated by neuropeptides, namely SP. Moreover, MC have been implicated in all phases of wound repair. However, there is scarce information about their function in DM skin and participation in DM-abnornal healing. To investigate this subject, MC were evaluated in the skin of DM patients and mouse models. DM skin showed increased pre-wounding MC degranulation that was associated with local and systemic inflammation. In addition, post-wounding MC degranulation was observed in non-DM mice but not in DM, while MC stabilization reversed this effect and ameliorated healing in DM mice. Moreover, MC deficient mice, with or without DM, showed abnormal wound healing. These results indicate that the presence of intact MC in unwounded skin and post-wounding degranulation are required for optimal healing, while pre-wounding MC degranulation has similar effects to MC absence. Taken together, these findings suggest MC stabilization as a potential target for novel DFU therapies. Finally, new biomaterials that offer targeted and controlled delivery of multiple effectors involved in wound repair, namely neuropeptides and endothelial cell (EC) precursors, were tested in experimental models of DM wound healing with promising results. This indicates that such tested bioproducts may prove useful for DFU treatment. In summary, the results presented in this thesis clarify the mechanisms of DM-impaired wound healing and identify possible novel therapeutic strategies for DFU with high translational potential. Future studies will be required to validate these results in other pre-clinical models and to optimize treatments.