Mechanisms of induced pluripotency: The role of the Nucleosome Remodelling and Deacetylase complex

Abstract

The reprogramming of somatic cells to naïve pluripotency can be robustly achieved by the forced expression of four reprogramming factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Among these reprogramming transcription factors, Oct4 plays a central role, as it is sufficient and essential for the induction of pluripotent cells. Oct4 interactome studies in embryonic stem cells (ESCs) revealed members of the Nucleosome Remodelling and Deacetylase (NuRD) complex as its highest confidence interactors. Mbd3 is an essential subunit of the NuRD complex, in the absence of which the complex is not assembled. Embryos lacking Mbd3 die shortly after implantation and Mbd3-null ESCs are viable but show severely impaired lineage commitment. Since the NuRD complex is a high confidence interactor of Oct4 and a key regulator of developmental cell state transitions, I investigated if NuRD is also involved in the biological process of the induction of pluripotency. I have addressed this question by means of genetic deletion or siRNA to manipulate Mbd3 levels in somatic cells. I demonstrated that the reprogramming of neural stem cells (NSCs) to pre-induced pluripotent stem cells (preiPSCs) is impacted by Mbd3 genetic deletion, and that Mbd3-null cells have delayed reprogramming kinetics. Likewise, using an inducible Mbd3 deletion strategy, I showed that the longer Mbd3 is intact the more NSCs reprogram to preiPSCs and finally to iPSCs. Using post-implantation epiblast-derived stem cells (EpiSCs), I showed that the reduction of Mbd3 by RNAi results in a complete impairment of Klf4-dependent reprogramming to iPSC and a 6 fold reduction in efficiency during Klf2-Nanog-dependent reprogramming. Moreover, I also performed the inverse experiments to examine the impact of Mbd3 overexpression on reprogramming. I observed that Nanog-mediated reprogramming of MEF-derived preiPSCs is facilitated in rate and extent by increased Mbd3, which results in increased NuRD complex levels. This increase in efficiency seems to be the result of a synergistic function of Nanog and Mbd3 in inducing the transcription of key pluripotency genes prior to the induction of reprogramming. A similar outcome is observed for Nanog-dependent reprogramming of EpiSCs, where increased Mbd3 expression leads to increased efficiency. In summary, my results identify a key role of the Mbd3/NuRD complex in the induction of pluripotency and show that a chromatin complex which is required for cell differentiation also facilitates the reversion of these cells back to a pluripotent cell state.

A reprogramação de células somáticas a celulas estaminiais pluripotentes induzidas (iPSCs) pode ser conseguida através da sobreexpressão de quatro factores: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Oct4 desempenha um papel fundamental, sendo suficiente e essencial para a geração de células pluripotentes induzidas. Análise do interactoma do Oct4 revelou que as subunidades do complexo NuRD (do inglês Nuclessome remodelling and Deacetylase complex) são os seus interactores principais. A subunidade Mbd3 é essencial para a geração do complexo, já que a sua ausência leva a que o complexo não se forme. Delecção do Mbd3 não é compatível com desenvolvimento embrionário e, apesar de células estaminais embrionárias poderem existir sem Mbd3, estas apresentam problemas de diferenciação celular. Sendo o complexo NuRD um dos principais interactores do Oct4 e um complexo chave na regulação de transições celulares durante o desenvolvimento embionário, decidi investigar qual o papel desempenhado pelo NuRD no processo de pluripotência induzida. Para adereçar esta questão fiz uso de diferentes delecções genéticas e ARN de interfência para manipular os níveis de Mbd3 em células somáticas. Nesta tese demonstrei que a remoção de Mbd3 em células somáticas leva a uma reduzida eficiência de reprogramação de células neuronais estaminais (NSC) a preiPSCs e, que as células que eventualmente reprogramam demoram mais tempo a fazê-lo. Através da remoção do Mbd3 em diferentes períodos, mostrei que quanto mais tarde o Mbd3 for removido, maior é o número de NSC que reprogramam em preiPSCs e eventualmente em iPSCs. Igualmente, usando células estaminais pluripotentes obtidas do epiblasto após implantação do blastocisto (EpiSCs), demonstrei que a redução da expressão do Mbd3 por ARN de interferência impede a reprogramação mediada pela sobreexpressão do factor de reprogramação Klf4, e que a delecção genética do Mbd3 reduz até seis vezes a eficiência de reprogramação mediada pelos factores Klf2 e Nanog. Nesta tese investiguei também o impacto da sobreexpressão do Mbd3 na reprogramação celular. Demonstrei que a reprogramação mediada pelo Nanog de preiPSCs, obtidas de fibroblastos embrionários, a iPSCs, é facilitada pela sobreexpressão de Mbd3, que conduz a maiores níveis de complexo NuRD. Este aumento de eficiência parece ser fruto da sinergia entre o Nanog e o Mbd3 na indução de transcrição de genes necessários para pluripotència, antes da reprogramação das células em iPSCs. Resultados semelhantes foram obtidos na reprogramação de EpiSCs a iPSCs, onde a co-sobreexpressão de Nanog e Mbd3 leva a um aumento da eficiência da reprogramação celular. Nesta tese demonstrei que o complexo NuRD desempenha um papel vital na formação de células estaminais pluripotentes induzidas e que um complexo previamente associado a diferenciação celular também desempenha um papel na reversão a um estado pluripotente.