Filmes Finos de Titânio-Zircónio para osteointegração

Abstract

Os biomateriais têm-se desenvolvido em face da necessidade de satisfazer uma procura clínica cada vez mais exigente alargando os limites de utilização. Reconhecendo no Titânio excelentes propriedades mas também algumas limitações, essencialmente biomecânicas, a solução tem passado pelo desenvolvimento de algumas ligas de Titânio. A mais recente liga de Titânio desenvolvida uma liga de Titânio e Zircónio (TiZr) apresenta um reforço das propriedades biomecânicas em relação ao Titânio e uma osteointegração similar ou melhor do que o “gold standard” dos implantes atuais. As suas propriedades e características específicas como a composição química, a topografia estruturada e a energia de superfície são apontadas como favorecedoras da osteointegração, proporcionando uma cicatrização óssea mais rápida e estável. Neste contexto surgiu o nosso estudo, para desenvolver uma metodologia, controlada e reprodutível, que pudesse replicar as características do novo biomaterial e esclarecer in vitro de que forma participam nos processos de osteointegração. Para além disso, permitiu-nos também pesquisar outras formulações em relação com estas propriedades e características que pudessem ser majorativas para as etapas de cicatrização óssea. O nosso estudo decorreu em três etapas: 1) o desenvolvimento e otimização de processos e procedimentos para a elaboração do material; 2) a elaboração controlada e reprodutível do material; 3) a avaliação da sua bioatividade e biocompatibilidade in vitro. Usamos a técnica de pulverização catódica (“sputtering”) em modo magnetrão, para a produção de filmes finos de espessura sub-micrométrica e composição química controlada. A aplicação simultânea de técnicas de análise da composição, estrutura e morfologia dos filmes produzidos permitiu-nos otimizar os procedimentos por forma a mimetizarmos as características do biomaterial em análise comparativa. Assim, as condições otimizadas de deposição foram estabelecidas em: • tempo de deposição 15 minutos; • polarização do substrato -40 V; • porta substratos em cobre; • velocidade de rotação do substrato 23 rpm; • número de pastilhas de Zircónio do alvo composto de Titânio com Zircónio - 11 pastilhas. Estas condições permitiram elaborar um filme de TiZr com 1 mm de espessura, com cerca de 15% em peso de Zircónio e com características “feature less” que não alteravam a topografia do substrato. No seguimento do estudo utilizámos então estas condições para elaborarmos de forma controlada e reprodutível os filmes de TiZr sobre substratos de TiZ maciço e com tratamento de superfície SLA (Sandblasted, Large grit, Acid etched). Produzimos 2 filmes distintos: ➢ filme TiZr com 15% em peso de Zircónio e 1 mm de espessura; ➢ filme TiZr com 7% em peso de Zircónio e 1 mm de espessura. A análise da composição com EDS (espectrometria de dispersão de energia) permitiu qualificar e quantificar a presença dos elementos Titânio e Zircónio nas referidas proporções. A análise topográfica com microscópio de alta resolução de variação de foco infinita confirmou a manutenção de uma topografia similar das amostras revestidas com os filmes, traduzindo uma influência não significativa dos mesmos sobre a topografia. A bioatividade in vitro foi avaliada através do potencial da energia da superfície e formação de precipitados de fosfato de cálcio, enquanto que a citotoxicidade e viabilidade celular in vitro foram avaliadas com cultura celular de células osteoblásticas MG63 em contacto direto sobre os biomateriais. O potencial Zeta da energia de superfície revelou a existência de uma energia de superfície relativamente elevada em valor absoluto, mas de carga negativa, e que aumenta com o aumento do teor em Zircónio, de acordo com a carga negativa do Zircónio em pH neutro; ambos os factores são favorecedores de uma bioatividade elevada na interface da superfície do material. A formação de precipitados de fosfato de cálcio ocorreu em todas as superfícies de forma significativa e seguindo o padrão descrito: na formação inicial há maior número de precipitados de cálcio e só depois se formam os precipitados de fósforo, como também na aproximação à relação estequiométrica mais estável próxima da hidroxiapatite. O comportamento dos filmes de TiZr com 15% de Zircónio seguiu o comportamento das amostras de TiZr maciço. A citotoxicidade e viabilidade celular in vitro mostrou que no final do dia 1 de cultura não havia diferença no número médio de células aderidas e/ou viáveis, baseado no ensaio da resazurina que, através da actividade mitocondrial das células em cultura, avalia o seu estado proliferativo e a sua viabilidade. Ao final do dia 4 e dia 7 de cultura o número de células viáveis e em estado proliferativo era significativamente diferente entre as superfícies. Significativamente mais células estavam aderidas e viáveis no dia 4 e 7 na superfície do filme Ti15Zr R550 do que na superfície TiZr (p< 0.05) e também significativamente mais células viáveis foram encontradas na superfície cp Ti SLA aos dia 4 e 7 quando comparadas com a superfície Ti15Zr R550. Este comportamento deverá ser atribuído por um lado à falta de estruturas nanométricas na superfície SLA do TiZr, pois elas existem apenas no SLActive (forma comercializada desta superfície), e por outro à existência das mesmas nos filmes TiZr e à nano textura dos filmes, como comprovado morfologicamente por SEM. Assim do nosso estudo, considerando os limites do mesmo e atendendo às condições em que se realizou, concluímos: - a técnica de pulverização catódica em modo magnetrão permite desenvolver filmes finos de forma controlada, os quais podem ser utilizados para estudos in vitro e in vivo de avaliação entre as características da superfície e os processos de cicatrização óssea e biocompatibilidade. - o método desenvolvido permitiu desenvolver um filme fino TiZr com composição química controlada e características “featured-less”, i.e., sem variação topográfica; - os filmes com a espessura de 1 μm ao serem depositados sobre um substrato de cp Ti SLA contribuíram para aumentar a superfície disponível da amostra; - os filmes produzidos apresentam uma topografia com características nanométricas que condicionam as propriedades biológicas; - os filmes produzidos não apresentaram efeitos citotóxicos nas células osteoblásticas MG63; - o modelo presente, podendo ser optimizado, permitirá avaliar a importância dos diferentes elementos do filme no potencial biológico; - o modelo presente permitirá desenvolver superfícies para avaliar a importância das diferentes características das superfícies in vivo.

Biomaterials have been developed due to the need to satisfy an increasing clinical demand, pushing the boundaries of their use. Recognizing Titanium´s excellent properties but also some limitations, mainly biomechanical, solutions have passed through the development of some titanium alloys. The latest developed titanium alloy, an alloy of Titanium and Zirconium (TiZr) shows an increase of the biomechanical properties relative to titanium, and osseointegration similar or better than the “gold standard” of the present implants. Their specific properties and characteristics such as chemical composition, structured topography and energy surface are identified as promoters of osseointegration, providing a faster and more stable bone healing. In this context, appears our study, to develop a controlled and reproducible methodology, which could replicate the characteristics of the new biomaterial and clarify in vitro how it participates in the process of osseointegration. Furthermore, it has enabled us to research other formulations in relation to these properties and characteristics that could be of more value concerning the stages of bone healing. Our study consisted of three stages: 1) development and optimization of processes and procedures for the preparation of the material; 2) controlled and reproducible preparation of the material; 3) in vitro evaluation of their bioactivity, cytotoxicity and biocompatibility. Sputtering technique in magnetron mode was used for producing thin films of sub-micron thickness and controlled chemical composition. The simultaneous application of techniques for analyzing the composition, structure and morphology of the produced films allowed us to optimize procedures and mimic the characteristics of the biomaterial in comparative analysis. Thus, the optimized conditions of deposition were set at: • deposition time 15 minutes; • substrate polarization -40 V; • copper substrate supports; • rotational speed of the substrate 23 rpm; • number of Zirconium tablets from target compound Titanium Zirconium - 11 tablets. These conditions permitted a TiZr thin film 1 µm thick, with about 15% weight of zirconium and with characteristics “ feature less “ that do not alter the topography of the substrate. Continuing our study we then used these conditions to elaborate in a controlled and reproducible manner TiZr films on bulk TiZr substrates with SLA surface treatment (Sandblasted, Large grit, Acid etched). We produced two different films: • TiZr film 15% weight of zirconia and 1 µm thick; • TiZr film 7% weight of zirconia and 1 µm thick. The composition analysis with EDS (energy dispersive spectroscopy) allowed to qualify and quantify the presence of the titanium and zirconium components in these proportions. The topographic analysis with high resolution microscope of infinite focus variation, confirmed the maintenance of a similar topography of the samples coated with films, meaning it had an insignificant influence on the topography. The in vitro bioactivity was assessed using the surface energy´s potential and the formation of precipitates of calcium phosphate, whereas in vitro cell viability and cytotoxicity were assessed using of MG63 osteoblast cell cultures in direct contact with biomaterials. The Zeta potential of surface energy has revealed the existence of a relatively high surface energy as an absolute value, but having a negative charge, which increases with increasing zirconia content, in accordance with the negative charge of zirconium at neutral pH; both factors favor a high bioactivity in the material surface interface. The formation of precipitates of calcium phosphate occurred on all surfaces in a substantial manner following the pattern described: the initial formation contains a higher number of calcium precipitates and only later phosphorus precipitates formed, also on the approach to a ratio close to hydroxyapatite. The behavior of TiZr films with 15% zirconia followed the behavior of the solid TiZr samples. Cytotoxicity and cell viability in vitro showed that at the end of day 1 of culture there was no difference in the average number of adhered and / or viable cells, based on resazurin test of the mitochondrial activity of cells in culture, evaluates its proliferative status and viability. At the end of day 4 and day 7 of culture the number of viable cells and proliferating states was significantly different between the surfaces. Significantly more cells were attached and viable on day 4 and 7 on the film surface Ti15Zr R550 than on the TiZr surface (P <0.05) and also significantly more viable cells were found on the surface cp Ti SLA the 4th and day is 7th as compared to the surface Ti15Zr R550. This behavior should be attributed on one hand to the lack of nanoscale structures on the SLA surface of TiZr, because they exist only on SLActive (marketed form of this surface), and on the other hand, the existence of the same structures in TiZr films and nano texture of the films, as morphologically confirmed by SEM. Thus in our study, considering the limits of the same and given the conditions in which it was performed, we conclude: • sputtering technique in magnetron mode allows thin films to develop in a controlled manner, which can be used for in vitro and in vivo assessment of the surface characteristics and the process of bone healing and biocompatibility; • the method developed allowed TiZr to develop a thin film with controlled chemical composition and characteristics “featured-less”, that is, without topographic variation; • thin films with a thickness of 1 µm when deposited on a substrate of cp Ti SLA contributed to increase the available surface of the sample; • thin films produced exhibit a topography with nanometric features that condition the biological properties; • thin films produced showed no cytotoxic effects on osteoblastic MG63 cells; • present model, can be optimized, allowing to assess the importance of different elements of the film on the biological potential; • present model will allow to develop surfaces to assess the importance of the different characteristics of the surfaces in vivo.