A soft lithography method for patterning calcium phosphate ceramics

Abstract

Uma técnica inspirada na micromoldagem em capilares foi adaptada para produzir padrões de cerâmicos de fosfato de cálcio num substrato de silício, através da nucleação e crescimento de cristais a partir de uma solução supersaturada de iões de cálcio e fosfato. A solução foi infiltrada em microcanais definidos pelo molde de PDMS e pelo substrato de silício. A eficiência de infiltração por capilaridade foi testada em duas categorias de padrões, nomeadamente padrões de canais interconectados, e padrões de canais paralelos. A infiltração nos padrões de canais paralelos foi completa para um comprimento do canal até 1 cm, e para um tratamento de plasma de 1 min ao molde e ao substrato. O material depositado foi composto por nodos radiais de cristais alongados semelhantes a agulhas, que foram observados em regiões de densidade de nucleação elevada e crescimento cristalino limitado ou em regiões de densidade de nucleação baixa e crescimento cristalino extensivo. A fase cristalina foi identificada por difracção de raios-X como fosfato de di-cálcio desidratado (DCPA - di-calcium phosphate anhydrous) que mudou de fase para fosfato de tri-calcium beta (β-TCP - beta tri-calcium phosphate) quando as amostras foram sujeitas a um tratamento térmico a 950ºC durante 3 horas. O confinamento do material depositado, e a distribuição de cálcio e fósforo dentro dos canais foi analisada por espectroscopia de dispersão de electrões. Foram obtidos perfis de libertação para o cálcio e fosfato, em meio de cultura de células, e não foram encontradas diferenças significativas na concentração iónica após 7 dias. A morfologia dos padrões não foi alterada significativamente após envelhecimento em meio de cultura por 3 dias. A biocompatibilidade dos substratos e proliferação celular foi avaliada com testes de viabilidade e quantificação de DNA. Foi observado um aumento de actividade metabólica ao longo dos 7 dias, mas a quantidade baixa de DNA nos dias 1 e 3 sugerem dificuldades de adesão ao substrato. Foi mostrado por microscopia de varrimento electrónica e immunofluorescência dos filamentos de actina que as células se apresentam esticadas e alinhadas na direcção dos padrões de linhas, e este efeito é mais pronunciado nas linhas mais estreitas (1 a 10 μm) do que nas linhas mais largas (20 to 80 μm). Vinculina foi encontrada dispersa no citoplasma, enquanto a cinase de adesão focal foi observada por vezes concentrada em pontos de adesão situados na orla das células, indicando a possível formação de adesões focais no material cerâmico. A dinâmica de crescimento dos cristais foi observada em tempo real com uma mini câmara de incubação e microscopia de time-lapse, e esta plataforma mostrou resultados promissores para o estudo de crescimento de cristais em espaços confinados.