Projesterone in preterm birth: role of regulatory T-cells

Abstract

O Parto pré-termo (PTL) é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade neonatais, sendo responsável por 11% de todos os partos, ocorrendo espontaneamente na maioria dos casos. Mesmo as crianças que sobrevivem a um PTL têm maior incidência de sequelas a longo prazo, abrangendo défices de desenvolvimento psico-motor, patologia neurológica (como a paralisia cerebral) e um aumento do risco de doenças da vida adulta. As mulheres com ameaça de parto pré-termo revertida com tocólise, mantêm um risco elevado de episódios recorrentes. A terapia tocolítica de manutenção é ainda controversa mas o uso de progesterona nestes casos, tem-se revelado promissora. No entanto, a sua utilização não está ainda bem protocolada, para o que contribui a ausência de explicação científica clara para o seu modo de atuação. Assim, na gestação, a progesterona atua como um imuno-esteróide, contribuindo para o estabelecimento de um meio protetor. Durante a gravidez, a função primordial das células T reguladoras (Treg) circulantes parece ser a proteção da unidade feto-trofoblástica da rejeição pelo sistema imunológico materno, sob a influência da progesterona. As células Treg medeiam a sua função protetora através do contacto célula a célula ou pela secreção de citocinas imunossupressoras. Vários estudos demonstraram que a supressão da função dos leucócitos ativados pelas células Treg é obtida através da produção de IL-10 e TGF-β. Por outro lado, a progesterona apresenta-se como um regulador crítico das células Treg durante a gravidez mas através dum mecanismo ainda desconhecido. Recentemente foi encontrado no sistema imunológico humano um recetor membranar α de progesterona (mPRα), que contribui para os mecanismos não genómicos (rápidos) desta hormona. Este recetor poderá mediar as ações da progesterona nas células Treg e subsequentemente no PTL. Estudos em humanos são inexistentes nesta temática e esta pesquisa propõe uma inovação na compreensão e tratamento do PTL. O nosso estudo incluiu 14 mulheres grávidas com PTL (grupo de estudo) e 20 grávidas normais (grupo controlo), de forma a proporcionar alguns resultados preliminares, tendo em conta os restritos critérios de inclusão definidos e a incidência da patologia em questão. A colheita de sangue periférico foi efetuada em 3 ocasiões em mulheres grávidas normais, para caracterização e quantificação de células Treg, determinação dos níveis plasmáticos de IL-10 e de TGF-β, e a expressão de mPRα. As mesmas determinações foram realizadas em mulheres internadas com PTL, também em 3 momentos (após tocólise, 24 horas após progesterona e no dia do parto). O estudo das células Treg e do mPRα em células Treg foi efetuado por citometria de fluxo, recorrendo à expressão de múltiplos anticorpos monoclonais que caracterizam estas populações. A nossa população de células T reguladoras foi definida como a portadora das seguintes características: CD4+CD25highCD127lowFoxp3+. As concentrações plasmáticas de citocinas (IL-10 e TGF-β) foram determinadas utilizando a técnica de Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), de modo a explorar a influência da regulação destas citocinas nos dois grupos de mulheres. Os transcritos de mRNA de Foxp3, mPRα, IL-10 e TGF-β foram determinados utilizando Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) e para confirmar a presença das respetivas proteínas foi realizado Western Blot. Após o parto, utilizando a metodologia imuno-histoquímica, foi estudada a percentagem de células Treg, os níveis de IL-10 e TGF-β e a existência de mPRα nas placentas de ambos os grupos. Por último, utilizando amostras de sangue obtidas do grupo PTL, foram executados estudos in vitro, de forma a determinar se o mecanismo subjacente às ações da progesterona em células Treg no PTL seria resultante da sua interação com o mPRα. Este estudo demonstrou um aumento no pool de células Treg após a terapêutica com progesterona de 38.3% para 52%, indicando um possível mecanismo através do qual o seu papel benéfico no PTL é alcançado. Além disso, a administração de progesterona traduziu-se num aumento de todas as populações celulares estudadas. Foi ainda possível corroborar a importância das citocinas imunossupressoras IL-10 e TGF-β na contenção do fenómeno imunoinflamatório, que se considera desencadear o PTL, ao demonstrar níveis mais elevados no grupo de estudo. Superando as nossas expectativas iniciais, esta investigação comprovou a existência de mPRα no pool de células Treg durante a gravidez humana (segundo trimestre, terceiro trimestre e dia do parto) e, adicionalmente, após tratamento com progesterona, foi possível constatar uma diminuição de células Treg mPRα+ de 32.6% para 13.8%, Este projeto estudou a capacidade da progesterona reduzir o número de PTL por modulação da percentagem das células Treg através do mPRα. Em conclusão, estes resultados permitem fundamentar cientificamente a forma de atuação da progesterona, de forma a justificar a sua prescrição preventiva e terapêutica no PTL, permitindo uma diminuição das consequências maternas e neonatais, com a subsequente redução das sequelas inerentes à prematuridade.

Preterm labour (PTL) is one of the major causes of neonatal morbidity and mortality worldwide, accounting for 11% of all deliveries, most of them occurring spontaneously. Even those children who survive a PTL have an increased incidence of long-term sequelae, including neurodevelopmental deficits (as cerebral palsy) and an increased risk of a spectrum of diseases in adulthood. Women with PTL arrested with tocolytic therapy remain at increased risk of recurrent preterm labour and, although maintenance tocolytic therapy is still controversial, progesterone use seems promising. Nevertheless, it is not universally used due to the lack of a scientific explanation to support its mode of action. Progesterone acts as an immunosteroid by contributing to the establishment of a pregnancy protective milieu. During pregnancy, the primordial function of circulating T regulatory (Treg) cells seems to be the protection of the fetal-trophoblastic unit from rejection by the maternal immune system, under the influence of progesterone. Moreover, Treg cells mediate its protective function via cell to cell contact or by the secretion of immunosuppressive cytokines. Several studies have shown that suppression of the function of activated leukocytes by Treg cells is achieved by the production of IL-10 and TGF-β. Furthermore, progesterone is thought to be the critical regulator of Treg cells during pregnancy, but the mechanism remains unclear. Membrane progesterone receptor α (mPRα) was recently found on human immune system and seems responsible for the rapid non-genomic actions of progesterone. This receptor could mediate progesterone actions on Treg cells and was demonstrated to be involved in PTL. Human studies are inexistent in this field and this research proposes an innovation in the understanding of preterm birth and on its treatment. Our study included 14 pregnant women with PTL (study group) and 20 normal pregnant women (control group), as these numbers would provide preliminary results, taking into account the restricted inclusion criteria and the incidence of the disease. Characterization and quantification of Treg cells, IL-10 and TGF-β plasma levels and the existence of mPRα was performed in peripheral blood on 3 occasions in normal pregnant women. The same determinations were conducted in women admitted with PTL, also on 3 occasions (after tocolysis, 24 hours after progesterone treatment and on delivery day) in peripheral blood. Treg cells and mPRα studies were done by flow cytometry analysis, using multiple monoclonal antibody expression that characterizes these cell populations. We defined our Treg cell pool as the one characterized by CD4+CD25highCD127lowFoxp3+. Cytokine plasmatic concentrations (IL-10 and TGF-β) were measured using “Enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA) technique to explore the influence of these suppressor cytokines in the two groups of women. The mRNA transcripts of Foxp3, mPRα, IL-10 and TGF-β were determined using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). To validate the presence of the respective proteins Western blot was performed. After birth, placentas of both groups were analyzed to determine Treg cells percentage, IL-10 and TGF-β levels and the existence of mPRα in both groups, using immunohistochemistry methodology.

Using the same blood samples retrieved from PTL group, in vitro studies were done, in order to prove that the mechanism behind Progesterone actions on Treg cells is linked to mPRα. This research demonstrated a significant increase in the Treg cell pool after progesterone treatment, from 38.3% to 52%, indicating a possible mechanism by which its beneficial role in PTL is achieved. Moreover, progesterone administration resulted in an enhancement of all blood populations being studied. Also, it attested the importance of the immunosuppressive cytokines IL-10 and TGF-β in the containment of the immunoinflammatory phenomenon, thought to prompt PTL, demonstrating higher levels in the study group. Exceeding our primary presumptions, we also attested the existence of mPRα in Treg cell pool during human pregnancy (second trimester, third trimester and delivery day), with surprising results revealing a decrease in mPRα+ Treg cells after progesterone treatment, from 32.6% to 13.8%. This exploratory research studied if progesterone’s ability to reduce PTL is achieved through modulation of Treg cells frequencies by means of mPRα. Finally, this study comes up to a scientific explanation to support the role of progesterone in PTL, allowing its preventive and therapeutic prescription, which will result in the reduction of pregnant women’s internments and of children’s intensive care requirements, with a subsequent reduction in children’s handicaps and hospital costs.