Characterization of KIR2DS1+ decidual Natural Killer cells in healthy and viral/bacterial – infected human pregnancy

Abstract

Human pregnancy is a challenge for the maternal immune system, which must maintain tolerance to a semi-foreign entity (the fetus) while keeping immunity against viral, bacterial and parasite infections. While the mechanisms involved in placental immune tolerance have been addressed for the last thirty years, very little attention has been given to the maternal immune system role in the elimination of infections. In preparation for implantation, the uterine endometrium undergoes modifications known as decidualization. The placental cells (trophoblast) invade the decidua to facilitate nutrient and gas exchanges. In particular, the extravillous trophoblast (EVT) of fetal origin detaches from placental villi, migrates into the decidual tissue and contacts directly with maternal immune cells such as decidual natural killer cells (dNK). dNK are the most abundant leukocyte type in decidua and have a different phenotype from peripheral NK cells (pNK). dNK have lower cytotoxicity in response to MHC-Class I – negative targets and secrete more cytokines and growth factors than pNK. dNK express high levels of killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR) that recognize MHC Class I in maternal tissue and EVT. EVT express HLA-E and HLA-G, in addition to polymorphic HLA-C. Recently, women who lack the gene for the activating receptor KIR2DS1 and carry a fetus expressing HLA-C2 (the ligand for KIR2DS1) were found to be at increased risk of recurrent miscarriage, fetal growth restriction and preeclampsia. The molecular and cellular mechanisms involved are unknown. The current hypothesis suggests that absence of activating KIR2DS1 and expression of KIR2DL1 (inhibitory receptor for HLA-C2) results in stronger inhibition of dNK upon interaction with fetal HLA-C2. This inhibition dampens dNK secretion of growth factors involved in placentation and vessel remodeling, leading to pregnancy complications. Particular combinations of KIR haplotypes and HLA allotypes are also associated with improved clearance of viral infection. Therefore we hypothesized that the protective effect of KIR2DS1 lies in a more efficient clearance of infections during early pregnancy. This may prevent virus-induced placental pathology and subsequent fetal and maternal complications. Both hypotheses are tested in the present work. In this thesis, human dNK phenotype and function in healthy pregnancy and viral/bacterial infections are characterized, focusing on the role of KIR2DS1. Chapter 1 of this thesis provides a general introduction to contextualize the data presented in the following chapters. Chapter 2 presents a characterization of KIR2DS1+ (S1+) dNK in healthy pregnancy. dNK are shown to express receptors for MHC Class I in higher frequencies than pNK, specifically KIR2DL1 and KIR2DS1, KIR2DL2/3 (inhibitory HLA-C1 receptors) and NKG2A/NKG2C (respectively, inhibitory and activating HLA-E receptors). dNK express similar levels of the cytolytic molecules granzyme A and B as pNK, but lower levels of the pore forming protein perforin. Strikingly, dNK express much higher levels of the antimicrobial peptide granulysin than pNK. In addition, the expression of granzyme B, perforin and granulysin are increased in S1+ dNK. These observations point to a higher cytolytic potential of S1+ dNK. In fact, cytotoxicity of dNK from KIR2DS1+¬ women was not as efficiently inhibited by HLA-C2+ target cells as dNK from KIR2DS1- women and pNK from all donors. S1+ dNK also displayed the highest levels of degranulation of all 4 subsets (L1+, S1+, L1+S1+, L1-S1-) in response to HLA-C2+ target cells. Although dNK degranulated and secreted cytokines in response to MHC Class I-negative or HLA-C2+ cell lines, co-culture with EVT did not elicit secretion of IFN-γ, VEGF or GM-CSF. The failure of KIR2DS1+ dNK to secrete cytokines in response to HLA-C2+ EVT led to the hypothesis that the higher cytotoxic potential of KIR2DS1+ dNK contributes to an increased clearance of placental viral infections, a possibility explored in chapter 3. Human cytomegalovirus (HCMV) is the most common congenital viral infection and can lead to miscarriages, fetal growth restriction and permanent hearing damage. In chapter 3, dNK were shown to degranulate and secrete pro-inflammatory cytokines in response to HCMV-infected decidual stromal cells (DSC). However, dNK did not respond to HCMV-infected choriocarcinoma cell line (JEG3) and sample-matched primary EVT. This demonstrates the high resistance to death by trophoblast and highlights the difficulties the maternal immune system faces to clear infections in the tolerogenic compartment of the placenta. Furthermore, KIR2DS1+ dNK were demonstrated to deliver an increased cytolytic response to HCMV-infected DSC expressing HLA-C2. This observation may explain the protective effect of KIR2DS1 in human pregnancy by limiting viral infection in the placenta. KIR2DS1+ dNK may control the spread of infection and reduce the risk for virus-induced pregnancy complications. Finally, in chapter 4, the role of dNK in the elimination of bacterial infections was investigated. The high expression of antimicrobial peptide granulysin by dNK was the basis for this study. dNK constitutively secreted high levels of granulysin. In addition, dNK cells and dNK supernatants were able to kill both extracellular and intracellular bacteria in JEG3 without killing the host cell. This effect was independent of degranulation. This striking result reveals a novel function for dNK and strengthens their role as immune effector cells.

A gravidez humana é um desafio para o sistema imunitário materno, o qual deve garantir tolerância a um feto semi-incompatível enquanto mantém imunidade contra infeções. Os mecanismos envolvidos na tolerância têm sido bastante explorados, mas o estudo da imunidade a infeções congénitas tem sido negligenciado. A implantação do embrião exige que o endométrio uterino sofra modificações profundas (decidualização). As células fetais da placenta (trofoblastos) invadem a decidua para permitir trocas eficientes de gases e nutrientes. Em especial, os trofoblastos extravilosos (EVT) migram para o tecido decidual, contatando directamente com linfócitos maternos como as células Natural Killer deciduais (dNK). As dNK são os leucócitos mais abundantes na decidua, mas são menos citotóxicas em resposta a células alvo que não expressam MHC Classe I que as NK do sangue (periféricas, pNK), e secretam mais citocinas e fatores de crescimento. As dNK expressam níveis elevados de recetores KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) que reconhecem proteínas MHC Classe I nos tecidos maternos e EVT. Os EVT expressam HLA-E e HLA-G e também HLA-C, que é polimórfico. Recentemente, foi encontrada uma associação prejudicial entre genes KIR maternos e alelos HLA-C do feto. As grávidas que não possuem o gene para o recetor ativador KIR2DS1 e cujo feto expressa HLA-C2 têm um risco elevado de aborto espontâneo, restrição de crescimento fetal e pré-eclâmpsia. Os mecanismos moleculares e celulares envolvidos não são conhecidos. A hipótese proposta atualmente sugere que a ausência de KIR2DS1 ativador e expressão de KIR2DL1 (recetor inibidor de HLA-C2) leva a uma inibição mais pronunciada das dNK aquando da interação com HLA-C2 fetal. Esta inibição reduz a secreção pelas dNK de fatores de crescimento envolvidos na placentação e remodelação de artérias uterinas, resultando em complicações na gravidez. São também conhecidas combinações de haplótipos de KIR com alelos de HLA que estão associadas a um melhor combate a infeções virais. Estes dados levaram à nossa hipótese de que o efeito protetor de KIR2DS1 está relacionado com uma resposta imunitária mais eficiente a infeções congénitas. Este fenómeno pode prevenir danos induzidos por vírus na placenta e consequentes complicações na gravidez. Ambas as hipóteses foram testadas no trabalho aqui apresentado. Nesta tese, é apresentada uma caraterização do fenótipo e função das dNK humanas em gravidezes saudáveis e afetadas por infeções virais ou bacterianas, com foco no papel de KIR2DS1. O capítulo 1 desta tese fornece uma introdução geral para contextualizar os dados apresentados nos capítulos seguintes. O capítulo 2 apresenta uma caraterização das dNK que expressam KIR2DS1 (S1+) em gravidezes saudáveis. A frequência de expressão de recetores para MHC Classe I nas dNK é mais elevada que nas pNK, em especial KIR2DL1 e KIR2DS1, KIR2DL2/3 (recetores inibidores de HLA-C1) e NKG2A/NKG2C (recetor inibidor e ativador, respetivamente, de HLA-E). As dNK contêm níveis semelhantes das proteínas citolíticas granzima A e B aos das pNK, mas níveis mais reduzidos de perforina, que forma poros nas membranas das células alvo. Em especial, as dNK contêm muito mais proteína anti-microbiana granulisina que as pNK. Ainda, a expressão de granzima B, perforina e granulisina é mais elevada em dNK S1+. Estas observações revelam um potencial citolítico elevado das dNK S1+. De facto, a citotoxicidade das dNK isoladas de grávidas que possuem o gene KIR2DS1 não foi inibida por células alvo HLA-C2+ com a mesma eficiência que dNK isoladas de grávidas sem KIR2DS1 ou pNK de todos os indivíduos da amostra. As dNK S1+ também demonstraram possuir a mais elevada citotoxicidade dos 4 subgrupos (L1+, S1+, L1+S1+ e L1-S1-) em resposta a células-alvo HLA-C2+. As dNK desgranularam (libertaram moléculas citolíticas) e secretaram citocinas em resposta a células alvo MHC- ou HLA-C2+, mas não secretaram IFN-γ, VEGF ou GM-CSF após cultura com EVT. A falta de resposta das dNK à interação com EVT levou à hipótese de que o potencial citotóxico das dNK S1+ contribui para um combate mais eficiente às infeções virais na placenta. O vírus humano citomegalovírus (CMV) provoca a infeção congénita mais comum e pode levar a aborto espontâneo, restrição do crescimento fetal e danos auditivos permanentes. No capítulo 3, mostrou-se que as dNK desgranulam e secretam citocinas pró-inflamatórias em resposta a células do estroma da decidua (DSC) infetadas com CMV. No entanto, as dNK não responderam a células de coriocarcinoma (JEG3) ou EVT primários infetados com CMV. Estas observações demonstram a resistência à morte dos trofoblastos e sublinham a dificuldade que o sistema imunitário materno enfrenta para eliminar infeções na placenta. Em especial, mostrou-se que as dNK S1+ são mais citolíticas em resposta a DSC HLA-C2+ infetadas com CMV. Esta observação pode explicar o efeito protetor de KIR2DS1 na gravidez humana ao limitar a infeção viral na placenta. As dNK S1+ podem controlar a disseminação da infeção e reduzir o risco de complicações da gravidez induzidas por vírus. Finalmente, no capítulo 4, investigou-se o papel das dNK na eliminação de infeções bacterianas. A expressão elevada do péptido anti-microbiano granulisina em dNK constituiu a base para este estudo. As dNK secretam granulisina constitutivamente, e as células dNK e sobrenadantes das suas culturas conseguiram eliminar bactérias extracelulares e intracelulares em JEG3 sem matar as células hospedeiras. Este efeito foi independente de desgranulação. Este importante resultado revela uma nova função das dNK e reforça o seu papel como células imunitárias efetoras.