Inflammation in Alzheimer's disease: deregulation and modulation of miRNA expression in the mononuclear phagocyte system

Abstract

A descoberta de pequenos RNAs não codificantes, que desempenham um papel crucial na regulação da expressão genética, despoletou uma revolução no dogma da biologia molecular. Os microRNAs (miRNAs) constituem a classe mais estudada destas moléculas e compreendem pequenos RNAs com 22 nucleótidos que ligam ao RNA mensageiro maduro, inibindo a sua tradução. O facto destes miRNAs e os seus RNAs mensageiros alvo não serem totalmente complementares permite um efeito amplo no que diz respeito ao impacto que um simples miRNA pode ter na tradução de várias proteínas. A expressão anómala de um miRNA ou de um conjunto de miRNAs afeta vários processos celulares, causando um distúrbio na homeostasia celular que pode conduzir a estados patológicos. O conjunto dos fagócitos mononucleares integra vários tipos celulares que, apesar de se encontrarem em diferentes tecidos, partilham funções e fenótipos. A microglia e os monócitos são células deste conjunto que se encontram no cérebro e nos vasos sanguíneos, respetivamente. Na presença de um estímulo inflamatório, monócitos provenientes do sangue infiltram-se nos tecidos onde se diferenciam em macrófagos (derivados de monócitos), os quais controlam o ambiente inflamatório no tecido e realizam funções de “limpeza”. Os processos inflamatórios levados a cabo por estas células têm de ser estritamente controlados, no sentido de evitar situações de inflamação crónica. Neste contexto, os miRNAs têm emergido como reguladores indispensáveis na função dos fagócitos mononucleares. A microglia e outros fagócitos mononucleares têm sido largamente implicados em processos neurodegenerativos que são, normalmente, acompanhados por neuroinflamação descontrolada. Uma das doenças neurodegenerativas mais prevalentes e devastadoras é a doença de Alzheimer (DA), caracterizada pela acumulação de peptídeos β amilóide (Aβ) no cérebro, conduzindo à morte neuronal. A teoria mais consensual que justifica a excessiva deposição de Aβ no parênquima cerebral defende que a microglia perde a capacidade de fagocitar este peptídeo devido à aquisição de um forte fenótipo pró-inflamatório M1. Tem vindo a ser proposto que, no contexto da DA, os monócitos circulantes possuem a capacidade de infiltrar o parênquima cerebral, desempenhando funções imunitárias que, numa situação não patológica, seriam realizadas pela microglia. O trabalho desenvolvido no âmbito desta Tese teve como objetivo compreender o modo como os processos e intervenientes acima descritos estão interligados e contribuem para a progressão da DA. Neste contexto, procurou-se clarificar os mecanismos pelo quais os miRNAs inflamatórios controlam a função dos fagócitos mononucleares nesta doença. Verificou-se que a expressão do miR-155-5p se encontra aumentada no modelo triplo transgénico de Alzheimer (3xTg DA), antes do aparecimento de agregados extracelulares de Aβ, e também em microglia ativada com Aβ. Já que o aumento da expressão do miR-155-5p tem vindo a ser relacionado com o fenótipo de ativação M1 em macrófagos, este resultado sugeriu que o cérebro dos ratinhos 3xTg DA poderia apresentar um ambiente pró-inflamatório. A favor desta proposta foi observado que os níveis de IL-6 e IFN-β estão aumentados no cérebro destes animais, bem como em microglia ativada com Aβ. Para além disso, a potenciação da expressão do mR-155-5p nos ratinhos 3xTg AD foi correlacionada com a diminuição dos níveis da proteína SOCS-1, essencial para o passo de resolução da inflamação. Verificou-se ainda que o fator de transcrição c-Jun se encontra aumentado nos ratinhos 3xTg DA e que o seu silenciamento contribui para uma diminuição significativa da expressão do miR-155-5p em células da microglia, após ativação com Aβ. Dada a contribuição dos fagócitos mononucleares para a remoção de depósitos de Aβ em modelos animais da DA, era essencial perceber se no ser humano a função destas células está de alguma forma comprometida, num contexto clínico, especialmente no que diz respeito a funções celulares como a quimiotaxia e a fagocitose. Estas funções são essenciais para a infiltração destas células no cérebro, bem como para a remoção de Aβ, e podem ser influenciadas pela expressão de miRNAs. Verificou-se que os miRNAs miR-155-5p, -154-5p, -200c-3p, -27b- 3p e -128-3p se encontram diferencialmente expressos em monócitos circulantes de doentes diagnosticados com a DA, em comparação com controlos com a mesma idade e com doentes com défice cognitivo ligeiro (DCL), o que evidencia o seu potencial como biomarcadores da doença. Alguns destes miRNAs estão previstos ligar a recetores de quemoquinas, como é o caso do CCR2, e a proteínas envolvidas no processo de fagocitose, bem como a vários genes de risco para esta doença, incluindo o TREM2. Assim, foi interessante observar que o eixo CCR2/ CCL2 está comprometido nos monócitos de doentes com DA e com DCL, causando um défice na migração celular. Para além disso, verificou-se que a diminuição da fagocitose de fibrilhas de Aβ por parte dos macrófagos derivados destes monócitos está relacionada com alterações na expressão e processamento do TREM2. Por último, foi demonstrado neste Trabalho que os monócitos derivados da medula óssea, que se apresentam positivos para os marcadores CX3CR1 e CCR2, quando injetados na corrente sanguínea de ratinhos do modelo de DA que possui 5 mutações (5XFAD), são capazes de migrar para o parênquima cerebral na ausência de irradiação. A entrega ex vivo de oligonucleótidos complementares ao miR-23a-3p, usando lipossomas catiónicos (DLS), resultou no aumento de expressão do recetor CCR2 nestes monócitos. Aquando da injeção destas células na corrente sanguínea de ratinhos 5XFAD verificou-se uma diminuição significativa da deposição de Aβ nos vasos sanguíneos cerebrais destes animais. Estes resultados confirmam que o CCR2 é essencial para a remoção de Aβ vascular no contexto da DA e sugerem o que o miR-23a- 3p pode constituir um potencial alvo terapêutico a ser modulado em células mononucleares periféricas, no contexto da DA. De um modo geral, os resultados apresentados nesta Tese vêm confirmar o papel dos miRNAs como reguladores importantes da função dos fagócitos mononucleares na DA, e demonstram que estas pequenas moléculas, para além de contribuirem para o despoletar dos processos inflamatórios nesta doença, podem ser úteis no seu diagnóstico e no desenvolvimento de terapias novas e mais eficazes.

The discovery of small RNAs, which play a crucial role in the regulation of gene expression, has led to a significant revolution in the molecular biology dogma. The most extensively studied class of these molecules includes microRNAs (miRNAs), small 22 nucleotide RNAs that bind to mature mRNAs, repressing their translation. The lack of total complementarity between the miRNA and its targets accounts for a broad effect, where one miRNA can impact the translation of multiple proteins. When the expression of one or a set of miRNAs is disrupted, several cellular outputs can be compromised, disturbing the cellular homeostatic balance and triggering pathological states. The mononuclear phagocyte system (MPS) comprises several cell types that, although with different tissue localizations, share cellular functions and phenotypes. Microglia and monocytes are MPS cells from the brain and blood vessels, respectively. During an inflammatory stimulus, blood-derived monocytes (BDM) infiltrate tissues and differentiate into monocytederived macrophages (MDM), which control the inflammatory environment and carry out cleaning functions. Primary inflammatory processes undertaken by these cells need to be tightly controlled to avoid chronic inflammation and, in this context, miRNAs have emerged as indispensable regulators of MPS function. Microglia and other MPS cells have been largely implicated in neurodegenerative processes which are accompanied by uncontrolled neuroinflammation. One of the most prevalent and devastating of these disorders is Alzheimer’s disease (AD), in which the accumulation of amyloid β (Aβ) peptides in the brain causes neuronal death. The most consensual theory for excessive Aβ deposition advocates that microglia loses the ability to phagocyte this peptide, due to the acquisition of a strongly pro-inflammatory phenotype (M1). BDMs have been proposed to infiltrate the brain parenchyma in AD and carry out immune functions which, in a nonpathological situation, would be performed by microglia. The work developed in the context of this Thesis aimed at understanding how the abovementioned processes and players are interconnected and contribute to AD progression. In this regard, an effort was made to clarify how inflammatory miRNAs control the function of MPS cells in AD. MiR-155-5p expression was found to be upregulated in 3xTg AD mice, before the appearance of extracellular Aβ aggregates, and in microglia following Aβ activation. Since the increase of miR-155-5p expression has been correlated with the establishment of the M1 activation phenotype in macrophages, this increment hinted on the presence of a proinflammatory environment in the brain of the 3xTg AD mice. This was further confirmed by the observed increase in IL-6 and IFN-β levels in these animals, as well as in Aβ-activated microglia. Moreover, miR-155 upregulation in 3xTg AD mice was suggested to play a role in the downregulation of the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS-1), a protein essential during the resolution stage of inflammation. Importantly, the transcription factor c-Jun was found to be upregulated in 3xTg AD mice and its silencing led to a significant decrease in miR- 155-5p expression in Aβ-activated microglia cells. Given the contribution of BDMs to Aβ clearance in AD mouse models, it was essential to understand if, in humans, these cells are compromised in the context of disease, regarding cellular functions such as chemotaxis and phagocytosis. These cellular outputs are essential for brain infiltration and Aβ clearance and can be influenced by the expression of miRNAs. Importantly, miR-155-5p, -154-5p, -200c-3p, -27b-3p and -128-3p were found to be differentially expressed in BDMs from AD patients, with respect to age-matched controls and mild cognitive impairment (MCI) patients, indicating their potential role as disease biomarkers. Of special remark is the fact that some of these miRNAs are predicted to bind to chemokine receptors, such as CCR2, and phagocytosis proteins, as well as to several AD risk genes, including the triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2). Interestingly, the CCL2/CCR2 axis was found to be impaired in BDMs from AD and MCI patients, causing a deficit in cell migration. Moreover, a decrease in MDM-mediated phagocytosis of Aβ fibrils was related with alterations in the expression and processing of TREM2. Finally, in this Thesis, it was demonstrated that CX3CR1+CCR2+ bone-marrow (BM)- derived monocytes, when intravenously injected in 5XFAD AD mice, are able to reach the brain parenchyma in the absence of irradiation. The ex vivo delivery of miR-23a-3p anti-sense oligonucleotides using cationic liposomes (DLS) resulted in increased expression of CCR2 in BM-derived monocytes, while the intravenous injection of these cells in 5XFAD mice led to a significant decrease in the deposition of vascular Aβ. These results confirm that CCR2 is essential for vascular Aβ clearance in AD and place miR-23a-3p as an immune therapeutic target to be modulated in peripheral myeloid cells, in an AD context. Altogether, this work affirms miRNAs as master regulators of MPS cell function in AD and demonstrates that, while these molecules contribute to the initiation of inflammation in this disease, they can also be useful to stage dementia and to generate new and effective therapeutic strategies towards AD.