Therapeutic potential of retinoic acid-loaded nanoparticles for brain repair

Abstract

As zonas subventricular (SVZ) e subgranular do hipocampo (SGZ) constituem os dois principais nichos neurogénicos no cérebro do mamífero adulto. Nestas regiões, existem células estaminais dotadas de multipotência e auto-renovação, e que podem originar novos neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. A compreensão dos mecanismos de diferenciação neuronal é crucial para o desenvolvimento de novas terapias celulares dirigidas à reparação do cérebro lesionado. Para este propósito, têm sido descritas e testadas várias proteínas e moléculas promissoras, embora com pouco sucesso. O ácido retinóico (RA) é um destes agentes pro-neurogénicos que se tem destacado por potenciar a neurogénese durante o desenvolvimento e na idade adulta. Infelizmente, parâmetros tais como a solubilidade, estabilidade e concentração ou posicionamento espácio-temporal comprometem o seu potencial terapêutico. A utilização de biomateriais surge assim como o suporte ideal para contornar estas limitações e consequentemente potenciar a diferenciação neuronal. Assim, o objectivo principal desta tese foi desenvolver uma plataforma mais segura e eficaz baseada na aplicação de nanopartículas com RA encapsulado para impulsionar o processo neurogénico em células estaminais neurais no cérebro adulto. No Capítulo 3, reportamos a utilização de nanopartículas com RA encapsulado como uma ferramenta com potencial de induzir diferenciação neuronal de células da SVZ. A entrega intracelular de RA através de nanopartículas levou à ativação de recetores de RA, diminuiu a capacidade estaminal e aumentou a expressão de genes pró-neurogénicos. É de salientar que este trabalho demonstrou a capacidade destas mesmas nanopartículas modularem o nicho neurogénico da SVZ in vivo. Adicionalmente, comparamos a dinâmica da expressão genética das fases iniciais de diferenciação induzida pelas nanopartículas com RA encapsulado ou por RA solubilizado. No entanto, a bioacumulação em áreas do organismo que não as pretendidas e a libertação contínua destes agentes podem induzir efeitos secundários indesejados. Neste sentido, otimizamos a formulação previamente descrita no Capítulo 3 de forma a ser controlada remotamente. Assim, no Capítulo 4 desenvolvemos uma formulação que é sensível à luz permitindo a libertação intracelular de RA com precisão espácio-temporal. O estímulo utilizado para desencadear a libertação de RA foi luz com comprimento de onda de 405 nm. O estímulo com luz promoveu o aumento transiente de espécies reativas de oxigénio (ROS) mediadas pela NADPH oxidase e presentes na mitocôndria culminando com a ativação da β-catenina e aumento de diferenciação neuronal. Esta resposta celular à luz aumentou ainda os níveis de expressão do receptor RA-alfa (RARα), resultando num aumento de neurogénese induzida por RA. Em suma, as formulações de nanopartículas desenvolvidas no curso deste trabalho oferecem novas perspetivas para o desenvolvimento de estratégias de regeneração cerebral, com o enfoque na modulação das fontes endógenas de NSC no cérebro adulto. A proteção do RA contra a degradação, a entrega intracelular e precisão espácio-temporais mediados por nanopartículas com RA encapsulado podem ser os fundamentos para o desenvolvimento de uma terapia inovadora para a regeneração do cérebro contra lesões e degeneração.

The subventricular zone (SVZ) and the hippocampal subgranular zone (SGZ) comprise two main germinal niches in the adult mammalian brain. Within these regions there are self-renewing and multipotent neural stem cells (NSC) which can ultimately give rise to new neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Understanding how to efficiently trigger NSC differentiation is crucial to devise new cellular therapies aimed at repairing the damaged brain. A vast array of proteins and molecules have been described to modulate NSC fate and tested in innovative therapeutic applications, however with little success so far. Of note, retinoic acid (RA) is a potent differentiating factor critical for both developing and adult neurogenesis. Unfortunately, concerns related to solubility, stability, concentration or spatial and temporal positioning can hinder its desirable effects. The use of biomaterials emerges as the ideal support to overcome these limitations and consequently boost NSC differentiation. Therefore, the aim of this thesis was to develop a safer and more efficient therapeutic platform based on RA-loaded nanoparticles to induce neurogenesis from the resident NSC present in the adult brain. In Chapter 3 we reported the use of RA-loaded polymeric nanoparticles as a potent tool to induce the neuronal differentiation of SVZ cells. Intracellular delivery of RA by nanoparticles activated RA receptors, decreased stemness and increased proneurogenic gene expression. Importantly, this work reported for the first time a nanoparticle formulation able to modulate the SVZ neurogenic niche in vivo. We further compared the dynamics of the initial stages of differentiation between SVZ cells treated with RA-loaded polymeric nanoparticles and solubilized RA. However, the balance between biomaterials and differentiating factors must be well established, since bioaccumulation in off-target areas and the uncontrolled release can generate undesired side-effects. For that reason, we further optimized our formulation to be remotely controllable. Accordingly, in Chapter 4 we developed a light-responsive nanoparticle formulation to control the release of RA while delivering it intracellularly with spatial and temporal precision. The stimulus used to trigger RA release from nanoparticles was light (405 nm laser), which demonstrated neurogenic capabilities by itself by activating β-catenin through the transient induction of mitochondrial- and NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species (ROS). This cellular response to light culminated in the upregulation of RA receptor alpha (RARα), resulting in enhanced RA-induced neurogenesis. In conclusion, this combinatory therapy induces an amplified neurogenic effect, offering great advantages to potentiate neuronal differentiation of NSC while allowing a temporal and spatial remote control of RA release. The nanoparticle formulations herein developed may ultimately offer new perspectives for brain regenerative strategies, focused in the modulation of endogenous NSC found in the adult brain. The protection of RA from degradation, intracellular delivery and spatial and temporal precision gathered by RA-loaded nanoparticles may be the grounds for the development of an innovative therapy for brain regeneration against injury and degeneration.