Involvement of the NPY system in the inflammatory responses mediated by retinal microglial cells: modulation by sitagliptin

Abstract

A retinopatia diabética é uma das principais complicações da diabetes, sendo também uma das principais causas de perda de visão e cegueira. O controlo eficaz da glicémia, dislipidémia e pressão arterial podem reduzir significativamente o risco de desenvolver esta doença. Além disso, as opções terapêuticas disponíveis atualmente são limitadas e invasivas, e no essencial, são utilizadas nas fases mais avançadas da doença. Deste modo, é prioritário desenvolver novas estratégias terapêuticas para a prevenção e tratamento da retinopatia diabética. Os processos inflamatórios têm sido apontados como tendo um papel importante na patogénese da retinopatia diabética. Foi demonstrado que vários processos inflamatórios, tais como o aumento dos níveis de monóxido de azoto (NO) e de citocinas pró-inflamatórias, e também a ativação das células da microglia, da via do NF-κB e da PKCζ estão relacionados com a rutura da barreira hemato-retiniana. A sitagliptina é um inibidor da dipeptidil peptidase 4 (DPP-IV) que é utilizada no tratamento da diabetes tipo 2. Resultados recentes revelaram que a sitagliptina previne a rutura da barreira hemato-retiniana e também o aumento dos níveis de interleucina (IL)-1β em retinas de animais com diabetes tipo 1 e tipo 2. Além do seu efeito na estimulação da secreção de insulina, a DPP-IV tem um papel importante no metabolismo do neuropeptídeo Y (NPY). Assim, a inibição desta enzima pode afetar as funções moduladoras do NPY. Neste estudo, pretendeu-se avaliar se a sitagliptina inibe a ativação das células da microglia da retina e a neuroinflamação, e se os efeitos deste fármaco são mediados pelo sistema do NPY, e em particular pela ativação dos recetores Y1. Os efeitos da sitagliptina foram avaliados em culturas primárias de retina e em culturas organotípicas de retina. Para induzir uma resposta inflamatória, ambas as culturas foram expostas ao lipopolissacarídeo (LPS) e os efeitos da sitagliptina foram testados, na ausência e na presença do antagonista dos receptores Y1 (BIBP3226). Nas culturas primárias de retina, a sitagliptina inibiu o aumento da imunoreactividade da isoforma indutível da sintase do monóxido de azoto (iNOS-IR) nas células da microglia e também o aumento da produção de NO Resumo vi induzidos por exposição a LPS. O bloqueio dos receptores Y1 inibiu parcialmente, mas não significativamente, o efeito da sitagliptina no aumento da iNOS-IR. No entanto, o antagonista do recetor Y1, BIBP3226, preveniu completamente o efeito da sitagliptina na produção de NO. Estes resultados sugerem que os efeitos da sitagliptina na inflamação podem ser mediados, pelo menos em parte e, sob determinadas condições, pela ativação dos recetores Y1. Os níveis do fator de necrose tumoral (TNF) e de IL-1β nas culturas primárias de retina não foram afetados pelo tratamento com sitagliptina nem pelo bloqueio dos recetores Y1. Contudo, resultados preliminares indicam que a sitagliptina atenua o aumento da imunoreactividade da IL-1β em células da microglia, induzido pelo LPS. Nas culturas organotípicas de retina, a sitagliptina preveniu as alterações na morfologia das células da microglia. Apesar de não ser significativo, este efeito foi parcialmente inibido pelo bloqueio dos recetores Y1, de modo semelhante ao que se tinha sido observado nas experiências em que se avaliou iNOS-IR em culturas primárias de retina, sugerindo que os efeitos da sitagliptina na morfologia das células da microglia não parecem depender da ativação dos recetores Y1. À semelhança do que foi observado nas culturas primárias de retina, a sitagliptina também inibiu o aumento da iNOS-IR em células da microglia nas culturas organotípicas. Mais uma vez, o bloqueio dos recetores Y1 inibiu, mas de forma parcial e não significativa, o efeito da sitagliptina. Por último, a sitagliptina não inibiu o aumento da expressão de mRNA da iNOS, induzido pelo LPS, mas o bloqueio dos recetores Y1 exacerbou o aumento da expressão de mRNA da iNOS induzido por LPS. Concluindo, estes resultados indicam que a sitagliptina tem efeitos anti-inflamatórios, controlando a reatividade das células da microglia, mas estes efeitos parecem ser mediados por vias de sinalização específicas, como por exemplo a da iNOS. Apesar dos resultados sugerirem que o sistema do NPY, e em particular o recetor Y1, poderá contribuir parcialmente para alguns dos efeitos da sitagliptina, serão necessários mais estudos para clarificar se a activação dos recetores Y1 está efetivamente a mediar os efeitos da sitagliptina.

Diabetic retinopathy is one of the most common complications of diabetes and is a leading cause of vision loss and blindness. Intensive glycemic control, blood pressure regulation and lipid-lowering therapy reduce the risk of developing this disease. Moreover, there are significant limitations in the therapeutic approaches available, which are invasive and mainly targeted for the later stages of the disease. Therefore, there is a great need to develop new therapeutic strategies for prevention and treatment of diabetic retinopathy. It has been shown that low-grade inflammatory processes play an important role in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Moreover, it has been reported that the blood-retinal barrier (BRB) breakdown is correlated with increased nitric oxide (NO) production in the retina, mainly via inducible nitric oxide synthase (iNOS), microglia activation, increased levels of pro-inflammatory cytokines, and nuclear factor-kB (NF-κB) and protein kinase C (PKCζ) activation. Sitagliptin is an inhibitor of dipeptidyl-peptidase-IV (DPP-IV) used for the treatment of type 2 diabetes. Recent published data has shown that sitagliptin can prevent the BRB breakdown. Additionally, it prevented the increase of interleukin (IL)-1β in the retinas of type 1 and type 2 diabetic animals. Besides stimulating insulin secretion, the inhibition of DPP-IV also affects the modulatory functions of neuropeptide Y (NPY), because DPP-IV is a key enzyme on the metabolism of NPY. In this study, we aimed to investigate whether sitagliptin is able to inhibit retinal microglia activation and neuroinflammation and whether the effects of sitagliptin are mediated by the NPY system, and particularly through Y1 receptor activation. Using primary retinal neural cell cultures and retinal organotypic cultures exposed to lipopolysaccharide (LPS) to trigger an inflammatory response, we evaluated the effects of sitagliptin in microglial reactivity, in the absence or presence of Y1 receptor antagonist (BIBP3226). In primary retinal neural cell cultures, sitagliptin was able to inhibit the increase in iNOS immunoreactivity (iNOS-IR) in microglial cells and NO production triggered by LPS. The blockade of Y1 receptor partially inhibited the effect of sitagliptin on the increase of iNOS-IR triggered by LPS, although not significantly. However, the Y1 receptor antagonist, BIBP3226, completely Abstract viii abolished the effect of sitagliptin on NO production, suggesting that Y1 receptor might mediate, at least in part, and under certain condition, the effect of sitagliptin on inflammation. Moreover, neither sitagliptin nor BIBP3226 affected tumor necrosis factor (TNF) or IL-1β levels in retinal neural cell cultures. However, preliminary results show that sitagliptin seemed to attenuate LPS-induced upregulation of IL-1β immunoreactivity (IL-1β-IR) in microglial cells. In cultured retinal explants, sitagliptin prevented the alterations in retinal microglia morphology. The blockade of Y1 receptor by BIBP3226 slightly inhibited the effects of sitagliptin, although not significantly, similarly as was observed in the experiments where iNOS-IR was evaluated in retinal neural cell cultures, suggesting that the effects of sitagliptin on microglia morphology appear to be not dependent of the activation of Y1 receptor. As in retinal neural cell cultures, sitagliptin also inhibited the increase in iNOS-IR in microglial cells in cultured retinal explants, and again, despite a tendency for a partial inhibition of the effect of sitagliptin when cultures were also exposed to the Y1 receptor antagonist, this effect was not statistically significant. Finally, sitagliptin did not inhibit the increase in iNOS mRNA expression triggered by LPS, but the blockade of Y1 receptor enhanced the increase in iNOS mRNA expression induced by LPS. In conclusion, these results clearly indicate that sitagliptin has anti-inflammatory effects by controlling the reactivity of microglial cells, but these effects of sitagliptin appear to affect specific targets or pathways, such as iNOS. Moreover, it seems that the NPY system, and particularly the Y1 receptor, might eventually partially contribute for some of the effects of sitagliptin, but further investigation is required to clarify whether Y1 receptor activation mediates the effects of sitagliptin