Disfunção celular face à hipóxia em cardiomiócitos sujeitos a condições de hiperglicémia

Abstract

Na Diabetes Mellitus existe uma desregulação da resposta celular à isquémia associada ao desenvolvimento de complicações como a retinopatia diabética e doenças cardiovasculares. Vários estudos sugerem que a hiperglicémia é um factor crítico envolvido na perda de resposta celular à hipoxia. Por exemplo, alguns estudos deste e doutros laboratórios demonstraram que a destabilização do HIF-1α parece constituir um mecanismo crítico para a disfunção e morte celulares em situação de hiperglicémia como a que se observa na Diabetes. Contudo, o mecanismo molecular associado à destabilização do HIF-1α em condição de hiperglicémia não se encontra bem esclarecido. O HIF-1 é um factor de transcrição induzido pela hipoxia que assegura a sobrevivência celular e proliferação endotelial em situação de depleção de oxigénio. O HIF-1α regula uma variedade de genes envolvidos no metabolismo anaeróbio da glicose, bem como promove a angiogénese nos tecidos sujeitos a isquémia através do aumento da expressão do factor de crescimento endotelial vascular. O objectivo deste estudo consistiu em avaliar o efeito do metilglioxal na estabilização do HIF-1α em condição de hipoxia em cardiomiócitos. Os cardiomiócitos foram sujeitos a hipoxia química (400 μM de CoCl2) durante 6 horas e nos últimos 30 min ou 3 horas de hipoxia adicionou-se ao meio de cultura metilglioxal (1mM ou 3mM). Quando apropriado, o proteossoma foi inibido com 20 μM de MG-132 durante 4 horas. Após os tratamentos as células foram processadas e os níveis de HIF-1α e dos conjugados endógenos de ubiquitina avaliados por Western Blot. A viabilidade celular foi avaliada pelo método MTT e a actividade do proteossoma 20S foi determinada pela degradação do substrato fluorogénico Suc-LLVY-MCA. O presente estudo pretendeu demonstrar que a acumulação de um metabolito da glicólise altamente reactivo, o metilglioxal, na diabetes compromete a resposta celular dos cardiomiócitos à hipoxia, através da destabilização do HIF-1α nestas condições. Pretendeu-se também avaliar se essa acção destabilizadora do HIF-1α pelo MGO é mediada pela degradação do HIF-1α pela via da ubiquitina-proteossoma Os resultados revelaram que a exposição dos cardiomiócitos ao metilglioxal em condições de hipoxia leva à diminuição dos níveis de HIF-1α intracelular e à inibição da actividade do proteossoma. Por outro lado, os níveis de conjugados endógenos de ubiquitina aumentam na presença de metilglioxal em condição de hipoxia. Com este estudo demonstrou-se que o metilglioxal diminui os níveis proteicos de HIF-1α em cardiomiócitos sujeitos a hipóxia e que essa destabilização pode estar associada à degradação deste factor de transcrição pela via ubiquitina-proteossoma.

Diabetes Mellitus is associated with a defective tissue response to low oxygen tension, a cardinal feature of major diabetes complications such as diabetic retinopathy and cardiovascular diseases. Previous studies suggest a critical impact of hyperglycemia in the cell ability to cope with and to survive under hypoxia. In fact, previous data obtained in our laboratory strongly suggest that hyperglycemia inhibits hypoxia-induced stabilization of HIF-1α, leading to cell death under hypoxia. However, the molecular mechanism that underlies hyperglycemia induced destabilization of HIF-1α remains unclear. Endothelial proliferation and the main adaptive responses of the cell to hypoxia are primarily regulated by the transcription factor HIF-1. HIF-1α is a transcription factor that regulates a number of genes that help cells to cope with hypoxia; some of these genes include glycolytic enzymes of the anaerobic metabolism and vascular endothelial growth factor, which in turn regulates angiogenesis. We investigated the effect of methylglyoxal in the destabilization of HIF-1α under hypoxia in cardiomyocytes. Cardiomyocytes were exposed to chemical hypoxia (COCl2 400 μM) for 6 hours, and in the last 30 minutes or the last 3 hours of the hypoxic treatment methylglyoxal (1mM or 3mM) was added to the culture medium. In some cases, the proteasome was inhibited with MG-132 20 μM for 4 hours. At the end of the incubation period, whole-cell lysates were analysed by immunoblotting to access the HIF-1α and ubiquitin-conjugates levels. Cell viability was evaluated using the MTT method and proteasome 20S activity was determined by the degradation of the fluorogenic peptide Suc-LLVY-MCA. The major purpose of the present study was to investigate the effect of methylglyoxal on destabilization of HIF-1α under hypoxia. Methylglyoxal is a highly reactive glycolytic intermediate that was shown to accumulate in cells and tissues of diabetic patients. The study also addressed the effects of methylglyoxal in the activity of the proteasome as well as the participation of the ubiquitin-proteasome system in methylglyoxal-induced degradation of HIF-1α in cardiomyocytes. Data showed a decrease in the levels of HIF-1α and an inhibition of proteasome activity when cardiomyocytes were incubated with methylglyoxal under hypoxia. Furthermore, data also showed that incubation of cardiomyocytes with methylglyoxal is accompanied by an increase in the levels of ubiquitinated proteins. In this study, we show that methylglyoxal decreases HIF-1α levels in cardiomyocytes under hypoxia and that such decrease is likely to reflect the proteasome dependent degradation of HIF-1α.