Mechanisms and possible function of SIRT3 in mESC

Abstract

Isoladas do pluriblasto do blastocisto de murganho, as células estaminais embrionárias, com a sua capacidade de auto-renovação e de diferenciação em todos os tecidos adultos, providenciam simultaneamente um excelente modelo de estudo das fases iniciais do desenvolvimento embrionário, com um potencial papel no campo da medicina regenerativa. Longe de compreender todos os mecanismos que governam a regulação da pluripotência e da diferenciação destas células pluripotentes, o metabolismo tem emergido como uma ferramenta para modular estes intricados processos de desenvolvimento celular. O paradigma actual em investigação em células estaminais é de que, durante a diferenciação, alterações metabólicas precedem alterações ao nível genético. Por outro lado, o controlo da actividade de enzimas relevantes para o metabolismo pode trazer também controlo da pluripotência de mESC. A sirtuína 3, principal deacetilase mitocondrial, tem como alvos enzimas do ciclo de Krebs, a cadeia transportadora de electrões, e da sua actividade advém um aumento da actividade dessas enzimas. É, por isso, associada á activação do metabolismo mitocondrial. Por esse motivo, seria interessante saber se a SIRT3 possui um papel na regulação da pluripotência e/ou diferenciação de mESC. O silenciamento da expressão de uma proteína providencia um modo de avaliar a importância dessa mesma proteína numa rede de sinalização ou numa via metabólica. Enquanto knockouts genéticos são algo difícil de obter, um knockdown de um gene é relativamente mais fácil de conseguir, enquanto se mantém uma especificidade de alvo que não é conseguida pelo uso de inibição farmacológica. Estes sistemas de knockdown baseiamse na tecnologia de interferência por RNA, um processo que inibe a expressão de uma proteína ao nível do transcriptoma. Para conseguir este silenciamento, introduzimos um siRNA, tendo como alvo a sequência de mRNA da proteína de interesse. Deste modo, pretendemos realizar o silenciamento da SIRT3, em mESC, através do uso de um shRNA que tem como alvo o mRNA da SIRT3. Como o propósito deste ensaio é realizar um silenciamento estável, utilizámos um plasmídeo que expressa o supracitado shRNA, incorporado pelas células estaminais por lipofecção. Assim, neste trabalho, pretendeu-se estabelecer um protocolo de silenciamento de uma proteína, com recurso à transfecção de um plasmídeo que expressa um shRNA que tem como alvo a SIRT3. Os resultados mostram que a transfecção de mESC não é tão simples e directa como previsto, e não pudemos obter uma cultura principalmente composta por células E14Tg2.a transfectadas. No entanto, conseguimos transfectar fibroblastos embriónicos de murganho (NIH-3T3) e ainda obtivemos uma cultura enriquecida em células transfectadas. Apesar disto, o silenciamento de SIRT3 não foi claro, e portanto, a avaliação deste silenciamento deve ser repetida.

First derived from the inner cell mass of the mouse blastocyst, Embryonic Stem Cells, with their capability of self-renewal and of differentiation in all adult tissues, simultaneously provide an excellent model for studying early development and can play a role in regenerative medicine. Far from understanding all the mechanisms that rule the regulation of pluripotency and differentiation of these pluripotent cells, metabolism has emerged as a tool to modulate these intricate cell development processes. The current paradigm in stem cell research is that, during differentiation, metabolic alterations precede changes in gene expression, and also, that through the control of the activity of certain, metabolically relevant enzymes, one can modify the “stemness” of mESC. SIRT3, regarded as the main mitochondrial deacetylase, targets metabolic enzymes belonging to the Krebs’ Cycle and also the Electron Transport Chain, and its deacetylating activity promotes the activity of these enzymes. It is then associated with the activation of the mitochondrial metabolism. Therefore, we took interest in whether there is role of SIRT3 in the regulation of pluripotency and differentiation of mESC. Protein silencing provides a means of assaying the importance of a given protein to signaling network or a metabolic pathway. While specific genetic knockouts are rather difficult to obtain, a gene knockdown is relatively easier to obtain while maintaining a specificity degree that can’t be achieved through pharmacological inhibition. These knockdown systems are often based on RNA interference, a process by which the cell inhibits gene expression on the transcriptome level. Here, we expected to silence the expression of SIRT3 in mESC by using a SIRT3 mRNAtargeting shRNA. As we aim for a relatively stable protein knockdown, we used shRNA expressing plasmids that were incorporated in mESC by Lipofection (a form of transfection). Thus, in this work, we aimed to establish a protein silencing protocol, with a SIRT3 shRNAencoding plasmid, previously transfected into the targeted cells. Results show that mESC are not as easy to transfect and select as previously reported, as we were not able to obtain a culture majorly composed of transfected E14Tg2.a cells. Nonetheless, we successfully transfected mouse embryonic fibroblasts (NIH-3T3), and obtained an enriched culture in transfected cells. Even so, the SIRT3 silencing rate was not clear, and further evaluation of this silencing should be performed.