Mecanismos de regulação de catecolaminas nas células cromafins : papel da interleucina 1-ß e do neuropeptídeo Y

Abstract

A activacao do eixo hipotalamo-glandula pituitaria-suprarrenal (HPA) pode modular o sistema imunitario. As citocinas e o neuropeptideo Y (NPY) sao reguladores do eixo HPA e ambos sao produzidos pela medula da supra-renal. A interleucina-1β (IL-1β) e uma citocina cuja funcao na libertacao de catecolaminas pelas celulas cromafins e ainda controversa. Por outro lado, o NPY e um neuropeptideo que pode ser co-libertado com as catecolaminas e ainda estimular a libertacao de catecolaminas pelas celulas cromafins humanas e de murganho. No entanto os mecanismos intracelulares acoplados a activacao dos receptores do NPY e a estimulacao da libertacao de catecolaminas ainda e desconhecido. O primeiro objectivo deste trabalho consistiu em estudar os mecanismos intracelulares acoplados a activacao do receptor Y1 do NPY que induzem um aumento da libertacao de catecolaminas (noradrenalina, NA e adrenalina, AD) pelas celulas cromafins de murganho. O antagonista do receptor Y1, BIBP 3226, inibiu o efeito estimulador do NPY, comprovando que o receptor Y1 esta envolvido no processo de libertacao de catecolaminas pelas celulas cromafins de murganho. Alem disso, verificou-se que libertacao de catecolaminas estimulada pela activacao do receptor Y1 ocorre atraves de um processo dependente de Ca2+. Por outro lado, o inibidor da sintase do monoxido de azoto (NOS) e o inibidor da guanidil ciclase (GC) tambem diminuiram o efeito estimulador do NPY, sugerindo que o monoxido de azoto (NO) e o monofosfato de guanosina ciclica (GMPc) produzidos sao importantes reguladores da libertacao de catecolaminas estimuladas por NPY. A funcao do NO como regulador da libertacao de catecolaminas foi, ainda, confirmada incubando as celulas com um dador externo de NO, o NOC-18, que estimulou a libertacao de catecolaminas de um modo semelhante ao observado com NPY. O efeito estimulador do NOC-18 foi tambem inibido na presenca do inibidor da GC, ODQ, o que sugere que o NO activa a GC levando a um aumento de producao de GMPc. De modo a avaliar o envolvimento de outras vias de sinalizacao intracelulares acopladas a activacao do receptor Y1 e a libertacao de catecolaminas, as celulas Mecanismos de regulacao de catecolaminas nas celulas cromafins: papel da interleucina-1β e do neuropeptideo Y 4 cromafins de murganho foram incubadas com inibidores das MAPK, PKC e PKA na presenca de NPY ou NOC-18. Os resultados mostram que o efeito estimulador do NPY foi inibido pelos inibidores das MAPK e da PKC; no entanto, o efeito do NOC- 18 foi apenas inibido na presenca do inibidor da PKC. Estes resultados sugerem que libertacao de catecolaminas estimuladas por NPY ocorre atraves da activacao de duas vias: a via das MAPK, independente de NO, e a via da PKC, dependente de NO. Em conclusao, esta parte do trabalho aqui apresentado demonstra que a activacao do receptor Y1 nas celulas cromafins de murganho induz um aumento na libertacao de catecolaminas de uma forma dependente de Ca2+ e ainda atraves da activacao das MAPK. A libertacao de catecolaminas estimulada pela activacao do receptor Y1 e ainda dependente da producao de NO, que por sua vez activa a GC e subsequentemente a PKC. Sabendo que a activacao do receptor Y1 induz o aumento da libertacao de catecolaminas pelas celulas cromafins de murganho e que a concentracao intracelular de catecolaminas e resultante de um equilibrio entre a libertacao e a sintese de catecolaminas, o segundo objectivo desta tese foi avaliar a existencia de uma interaccao molecular entre a activacao do receptor Y1 e o promotor da hidroxilase da tirosina (TH). Como modelo celular foi utilizado a linha celular SK-N-MC, que possui o receptor Y1 e que foi transfectada com um plasmideo contendo o gene da luciferase acoplado a um fragmento do promotor da TH humana. Este promotor da TH possui alguns dos locais de ligacao para factores de transcricao que sao importantes para a activacao do promotor da TH e a consequente inducao da expressao da TH. Um exemplo e o local de ligacao dos elementos de resposta ao AMPc (CRE). Assim, o aumento ou a diminuicao da actividade da luciferase corresponde a activacao ou inibicao do promotor da TH. A forscolina aumentou a actividade da luciferase e o NPY inibiu este efeito estimulador. O antagonista do receptor Y1, BIBP 3226, inibiu o efeito do NPY na activacao da luciferase pela forscolina. O inibidor da PKA produziu um efeito semelhante ao efeito do NPY, enquanto que o inibidor da PKC nao modificou a actividade da luciferase. Em conclusao, estes resultados sugerem uma relacao directa entre a activacao do receptor Y1 e o promotor da TH atraves da PKA. Como foi referido anteriormente, e ainda controverso o papel da IL-1β na libertacao do conteudo dos granulos cromafins pelas celulas cromafins. Assim, nos capitulos 5 e 6 foi avaliado o efeito da IL-1β na libertacao de catecolaminas e de NPY pelas celulas cromafins de murganho e humanas. Os resultados obtidos mostraram que a IL-1β aumenta a libertacao de catecolaminas e de NPY, sendo este efeito inibido pelo antagonista do receptor da IL-1 (IL-1ra). O papel do NPY na libertacao de catecolaminas estimulada pela IL-1β foi avaliado atraves da imunoneutralizacao do NPY com o anticorpo anti-NPY, verificando-se uma inibicao do efeito estimulador da IL-1β. Estes resultados sugerem que o efeito estimulador da IL-1β na libertacao de catecolaminas pelas celulas cromafins de murganho e humanas e, em parte, mediado pelo NPY. Por outro lado, nas celulas cromafins humanas a activacao das MAPK e a producao de NO com a consequente activacao da PKC e da GC sao as principais vias de sinalizacao intracelular responsaveis pelo efeito estimulador da IL- β na libertacao de catecolaminas nas celulas cromafins humanas. Nas celulas cromafins humanas foi ainda avaliado o papel da IL-1β na sintese de catecolaminas. Para tal, as celulas foram incubadas com um inibidor da hidroxilase da tirosina (TH), o AMPT, que inibiu o efeito estimulador da IL-1β, sugerindo a possibilidade de uma relacao entre a IL-1β e a TH. Uma vez que a actividade da TH e regulada pela fosforilacao dos seus residuos de Ser40, pela tecnica de Western Blot, verificou-se que uma incubacao de 2 minutos com IL-1β aumentou a fosforilacao do residuo Ser40 da TH. Nas celulas cromafins humanas foram ainda investigados os mecanismos intracelulares acoplados ao receptor Y3 cuja activacao estimula a libertacao de catecolaminas. A inibicao do efeito estimulador do NPY ocorreu na presenca do inibidor da NOS, e ainda pelos inibidores da GC, das MAPK, da PKC e da PKA. Por outro lado, a inibicao da PKA nao alterou o efeito estimulador do NOC-18 na libertacao de catecolaminas pelas celulas cromafins humanas, e o efeito estimulador do activador da PKA, a forscolina, foi inibido pelo inibidor da NOS, LNAME. Estes resultados sugerem que activacao do receptor Y3 das celulas cromafins humanas induz um aumento da libertacao de catecolaminas actuando pela via das MAPK e pela activacao da PKA que por sua vez estimula a producao de NO, responsavel pela activacao da GC e da PKC. Em conclusao estes resultados sugerem que a IL-1β podera ser um factor importante na regulacao de catecolaminas pelas celulas cromafins das glandulas supra-renais em situacoes fisiopatologicas, como em situacoes de stresse ou hipertensao. Por outro lado, sugere-se ainda que o NPY funcione como um elemento chave entre o sistema imunitario e a glandula supra-adrenal, contribuindo para um aumento adicional de catecolaminas que podera ser determinante para o agravamento de determinadas situacoes patologicas.