Resistência à radioterapia no cancro colorretal

Abstract

O cancro colorretal constitui o terceiro cancro mais comum e mais mortal em homens e mulheres, em Portugal. O tratamento com quimiorradioterapia é o tratamento padrão para os estádios mais avançados da doença, na medida em que promove a regressão tumoral e diminui o estadiamento T e N. No entanto, verifica-se que muitos doentes não respondem ao tratamento. A resistência à radioterapia tem vindo a ser investigada e têm sido testados diversos fármacos no sentido de sensibilizarem as células tumorais ao tratamento. Contudo, os mecanismos de radiorresistência ainda não são claros e a maioria dos marcadores moleculares sugestivos de radiossensibilidade ou radiorresistência não é utilizada na prática clínica para determinar a terapêutica mais adequada ao doente oncológico. Este estudo teve como objetivos estabelecer linhas celulares humanas de cancro colorretal e estudar a resposta das linhas celulares radiossensíveis e radiorresistentes após tratamento com radioterapia e com quimiorradioterapia in vitro e in vivo. Para estudar a radiorresistência, foram utilizadas duas linhas celulares humanas de cancro colorretal, a linha celular C2BBe1 e a linha celular WiDr. A indução de resistência foi feita através da administração semanal da dose de 2 Gy, em frações cumulativas, com um acelerador linear Clinac 600, Varian. Durante a indução de resistência, foi avaliada a resposta à radioterapia das linhas celulares nativas e das linhas celulares derivadas, através da irradiação das células com doses únicas de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 Gy; e obtiveram-se curvas dose-resposta. Estabelecidas as linhas celulares derivadas resistentes à radioterapia, procedeu-se ao estudo da sua resposta, bem como da resposta das linhas celulares nativas, após tratamento com radioterapia (2 e 10 Gy), com quimioterapia (20 μM 5-fluorouracilo) e com quimiorradioterapia (tratamento combinado de 20 μM 5-fluorouracilo e as mesmas doses de radiação dos tratamentos isolados). A atividade metabólica foi avaliada às 24, 48, 72 e 96 horas, através do ensaio do sal brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil)tetrazólio; a sobrevivência celular foi avaliada 12 dias após os tratamentos, com a realização do ensaio clonogénico; os danos no ácido desoxirribonucleico foram avaliados através do ensaio cometa imediatamente após os tratamentos; e a viabilidade, os tipos de morte celular e o stresse oxidativo foram avaliados com recurso a citometria de fluxo, 96 horas após os tratamentos. Para além destas técnicas, procedeu-se à realização de um protocolo de eletroforese bidimensional para avaliar a expressão proteica das linhas celulares WiDr, sensível e resistente à radioterapia. Por fim, estabeleceram-se modelos animais heterotópicos e avaliou-se a resposta dos xenotransplantes das linhas celulares WiDr sensível e resistente à radioterapia após tratamento com quimiorradioterapia (tratamento combinado de 66,6 mg/kg 5-fluorouracilo e 2 ou 10 Gy). Foi possível estabelecer duas linhas celulares derivadas da linha celular WiDr, WiDr/6x e WiDr/10x, após seis e dez frações cumulativas de 2 Gy, respetivamente. A linha celular C2BBe1 demonstrou possuir resistência intrínseca à radioterapia, não tendo sido possível aumentar essa radiorresistência. O tratamento com radioterapia e quimiorradioterapia produziu efeitos diferentes nas linhas celulares estudadas, sendo que a linha celular C2BBe1 foi maioritariamente afetada após quimiorradioterapia, no que diz respeito à sobrevivência, proliferação e danos no ácido desoxirribonucleico. Por outro lado, apresentou-se resistente aos tratamentos de radioterapia isolada. No que diz respeito às linhas celulares WiDr e derivadas, as últimas demonstraram maior atividade metabólica, sobrevivência e viabilidade celular, sobretudo nos tratamentos com maior dose de radiação. Contudo, não se verificaram diferenças significativas ao nível do stresse oxidativo e as linhas celulares resistentes demonstraram mais danos no ácido desoxirribonucleico do que a linha parental. Verificaram-se diferenças na expressão de proteína entre a linha celular WiDr e a linha celular WiDr/10x. Relativamente aos estudos in vivo, foi possível estabelecer dois modelos heterotópicos de cancro colorretal, com xenotransplante das linhas celulares WiDr e WiDr/10x. A comparação entre a resposta dos tumores sensíveis e dos tumores resistentes à radioterapia não revelou diferenças. Afigura-se que os estudos in vitro e in vivo deverão continuar com o intuito de compreender melhor os mecanismos de resistência à radioterapia.

Colorectal cancer is the third more common and more fatal cancer in Portugal for both men and women. Chemoradiotherapy is the standard treatment for locally advanced rectal cancer, since it promotes tumor local control and consequently tumor downstaging. However, many patients do not respond to treatment. Radioresistance has been investigated and several drugs have been tested in order to sensitize tumor cells to radiation. Unfortunately, the mechanisms beyond radioresistance have not been clarified yet and the majority of predictive molecular markers are not used in clinics in order to individualize treatment modalities. This study aimed to establish radioresistant colorectal cancer human cell lines and to evaluate radiotherapy and chemoradiotherapy response of both radiosensitive and radioresistant cell lines in vitro and in vivo. Two human colorectal cancer cell lines, WiDr and C2BBe1, were used to study radioresistance. Novel derivatives displaying significant resistance to radiotherapy were established by irradiating both cell lines with cumulative fractions of 2 Gy per week, using a Varian Clinac 600 linear accelerator. In vitro response to radiotherapy was assessed by clonogenic assay, after irradiating native and derivative cells with single fractions of 0, 2, 4, 6, 8 e 10 Gy. Plating efficiency was calculated and dose-response curves were obtained. After establishing radioresistant cell lines, the response of both radiosensitive and radioresistant cells was assessed after treatment with radiotherapy alone (2 and 10 Gy), chemotherapy (20 μM 5-fluorouracil) and chemoradiotherapy (combined treatment of both 20 μM 5-fluorouracil and the same doses of radiation used in radiotherapy alone). Metabolic activity was measured 24, 48, 72 and 96 hours after treatment using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide salt assay; survival was assessed 12 days after treatment by clonogenic assay; deoxyribonucleic acid damage was evaluated with comet assay immediately after treatment; and viability, cell death and oxidative stress were assessed by flow cytometry. In order to evaluate protein profile of both sensitive and resistant WiDr cell lines, two-dimensional electrophoresis was performed. Finally, the response of both sensitive and resistant WiDr cell lines to chemoradiotherapy (combined treatment of 66.6 mg/kg 5-fluorouracil and 2 or 10 Gy) was assessed in vivo after establishing two heterotopic colorectal cancer models. After six and ten cumulative fractions of 2 Gy, it was possible to establish two radioresistant derivatives of WiDr cell line, WiDr/6x and WiDr/10x, respectively. C2BBe1 cell line showed intrinsic resistance to radiotherapy and it was not possible to increase that radioresisntace. Radiotherapy and chemoradiotherapy induced different effects on cell lines. C2BBe1 cell line was mainly affected after chemoradiotherapy in respect of proliferation, cell survival and deoxyribonucleic acid damage. On the other hand, this cell line proved to be resistant to radiotherapy alone. In concern of native and derivative WiDr cell lines, the radioresistant ones demonstrated superior metabolic activity, cell survival and viability than their native, mainly for treatments with the highest dose of radiation. However, there were no statistically differences between sensitive and resistant cell lines regarding oxidative stress. Besides, radioresistant cells showed higher deoxyribonucleic acid damage than WiDr cell line. Differences in protein profile were observed between WiDr and WiDr/10x cell lines. When it comes to in vivo studies, there were no differences between treatment responses of both sensitive and resistant tumor xenografts. In vitro and in vivo studies should continue in order to better understand the mechanisms underlying radioresistance.