Low Doses of Ionizing Radiation Induce Angiogenesis After Radiotherapy

Abstract

Radiotherapy is one of the most used approaches to treat cancer. It is known that ionizing radiation (IR) has the potential to induce DNA damage in cells and lead to cell cycle arrest and apoptosis. Therapeutic doses of IR delivered inside the tumor volume during radiotherapy block cancer cell proliferation and induce cancer cell death. However, during radiotherapy, not only the tumor area is exposed to IR, but also the tissues surrounding the tumor are exposed to doses of IR lower than the therapeutic dose. These low doses of IR may affect several types of stromal cells, including endothelial cells (ECs), and they have the potential to modulate the microenvironment that surrounds the tumor. In vitro, it was shown that low doses of IR do not decrease survival or proliferation of ECs and increase the migration of these cells by activating VEGFR2. Therefore, these low doses of IR activate VEGFR2 in a VEGF independent manner by promoting the auto-phosphorylation of this receptor tyrosine kinase. In both Zebrafish and mice models, it was demonstrated that low doses of IR enhance embryonic and adult angiogenesis. In a tumor context, using two different mice tumor models, these low doses of IR promote tumor growth and metastasis in a VEGFR dependent manner. In addition, by an in vitro microarray study, S. Constantino’s unpublished results show that low doses of IR modulate the expression of several genes. From 28,869 genes represented on the array, 4,042 significantly changed with low dose IR, including several genes encoding angiogenic factors. These results were confirmed in vitro using microvascular lung EC targets. Our data suggest that the expression of several proangiogenic targets is upregulated 4 hours after IR exposure, followed by a decrease to levels similar to those found in non-irradiated cells. Our aim is to now validate these data in humans and evaluate if angiogenesis is promoted in tissues exposed to low doses of IR from patients with rectal cancer that received neoadjuvant radiotherapy. Our results show that ECs removed from specimens irradiated with low doses of IR present an overexpression of several pro-angiogenic factors 8 weeks after the end of the radiotherapy, when compared to the levels found in ECs removed from non-irradiated tissues. According to the clinical guidelines, the surgery should be done at the 8th week post-radiotherapy, preventing us from obtaining biopsies at earlier or later time-points. Taken together our results suggest that ECs exposed to low doses of IR have their angiogenic balance skewed toward a proangiogenic phenotype. This shift represents a mark that those ECs were submitted to a stimulus that led to an angiogenic response. These results have the potential to provide new contributions to understand the pro-metastatic effect of IR, leading to significant breakthroughs and advancing the state of the art in the field. Our findings will be of utmost importance to improve current oncology protocols.

A radioterapia é usada no tratamento de tumores malignos caracterizados por um crescimento descontrolado, capacidade de invadir tecidos adjacentes e metastizar. Sabemos que a radiação ionizante (RI) provoca danos no ADN, bloqueia o ciclo celular e induz morte celular. As doses terapêuticas de RI que são administradas no volume tumoral, durante a radioterapia, pretendem bloquear a proliferação das células tumorais e induzir a sua morte. Contudo, durante a radioterapia, não só a área tumoral é exposta a RI, mas também os tecidos que rodeiam o tumor são expostos a doses sub-terapêuticas de RI. Estas baixas doses podem afetar vários tipos de células do estroma, como as células endoteliais e poderão modular o microambiente que rodeia a área tumoral. Foi demonstrado in vitro que baixas doses de RI (menor que 0.8 Gy) não diminuem a sobrevivência ou proliferação de células endoteliais e que aumentam a migração destas células ativando o recetor 2 do VEGF (VEGFR2). Assim, estas baixas doses de RI ativam VEGFR2 independentemente da presença de VEGF, promovendo a auto-fosforilação deste recetor tirosina cinase. Em modelos de peixe-zebra e ratinho, foi demonstrado que baixas doses de RI induzem angiogénese em embriões e animais adultos. Num contexto tumoral, usando dois modelos de ratinho, as baixas doses de RI promovem o crescimento tumoral e a metastização através de um mecanismo dependente de VEGFR. Para além disso, resultados de uma análise de microarrays do nosso laboratório mostram que baixas doses de RI modulam a expressão de vários genes. Dos 28,869 genes representados no array, a expressão de 4,042 encontra-se significativamente alterada pelas baixas doses de RI, incluindo vários genes que codificam para fatores angiogénicos. Estes resultados foram confirmados usando células endoteliais microvasculares do pulmão. Os nossos resultados sugerem que a expressão de vários alvos pró-angiogénicos é aumentada 4 horas depois da irradiação, seguida de uma diminuição para níveis semelhantes aos encontrados em células não irradiadas. O nosso objetivo é agora validar estes resultados em humanos utilizando tecidos expostos, ou não, a baixas doses de RI de doentes com cancro do recto submetidos a radioterapia neoadjuvante. Os nossos resultados mostram que as células endoteliais removidas de amostras expostas a baixas doses de RI apresentam uma sobre-expressão de vários fatores pró-angiogénicos, 8 semanas depois do término da radioterapia, quando comparados com os níveis encontrados em células endoteliais de tecidos não irradiados. De acordo com aquilo que é definido na prática clínica, a cirurgia deve realizar-se na oitava semana pós radioterapia, o que nos impede de obter biópsias em momentos mais precoces ou tardios. Os nossos resultados sugerem que a balança angiogénica está em desequilíbrio havendo uma maior expressão de fatores pró-angiogénicos em células endoteliais expostas a baixas doses de RI. Este mesmo desequilíbrio poderá representar uma marca que essas células endoteliais foram submetidas a um estímulo que conduziu a uma resposta pró-angiogénica. Estes resultados têm o potencial para contribuir para a compreensão do efeito pró metastático da radiação ionizante, levando a avanços no estado da arte nesta área. As nossas descobertas serão da maior importância para melhorar os actuais protocolos de oncologia.