Preparation and Preclinical Evaluation of New Triterpenoid Compounds

Abstract

O cancro continua a ser uma das principais causas de morte a nível mundial. De acordo com os dados estatísticos, em 2012 morreram cerca de 8.2 milhões de pessoas devido a esta doença. Além disso, prevê-se que o número de novos casos diagnosticados de cancro aumente consideravelmente nas próximas décadas. Considerando que os fármacos antineoplásicos usados atualmente na clínica continuam a ter diversas limitações e efeitos secundários graves, é urgente desenvolver novos fármacos que tenham uma maior eficácia terapêutica no tratamento do cancro. Os produtos naturais têm sido uma fonte importante de leads para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos, nomeadamente os anticancerígenos. Na verdade, alguns dos medicamentos anticancerígenos mais usados na prática clínica são derivados de produtos naturais. Os triterpenóides pentacíclicos representam uma vasta classe de produtos naturais que exibe diversas actividades biológicas, incluindo a atividade anticancerígena. Devido a essa atividade, ao seu perfil relativamente seguro e à sua elevada disponibilidade na natureza, os triterpenóides pentacílicos são compostos interessantes para desenhar novos leads visando o desenvolvimento de fármacos inovadores para a prevenção e tratamento do cancro. O ácido asiático é um triterpenóide pentacíclico da série ursano cujas propriedades anticancerígenas têm vindo a ser extensivamente estudadas ao longo dos últimos anos. Este composto demonstrou ter efeitos anticancerígenos promissores tanto em ensaios in vitro como em ensaios in vivo. Além disso, estudos prévios demonstraram também que a modificação estrutural do ácido asiático pode potenciar a sua atividade anticancerígena. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo a preparação de novos derivados semissintéticos do ácido asiático, visando aumentar a sua actividade anticancerígena e obter compostos que possam vir a ser úteis para o desenvolvimento de novos tratamentos para o cancro. No decorrer desde trabalho foram idealizados e preparados com sucesso três painéis de novos derivados semissintéticos do ácido asiático. Esses painéis incluem derivados fluorados (3.1–3.26), A-nor (4.2, 4.5, 4.8, 4.12–4.30), amidas e ácidos hidroxâmicos (5.6–5.16). As estruturas químicas dos novos compostos foram elucidadas fazendo uso de várias técnicas analíticas incluindo 1H e 13C RMN, espectroscopia de infravermelho, espectrometria de massa e espectrometria de massa de alta resolução. As atividades antiproliferativas dos novos derivados preparados foram avaliadas num painel de linhas celulares cancerígenas (HT-29, HeLa, MCF-7, Jurkat, PC-3, A-375, e MiaPaca-2), e determinaram-se os valores IC50. A maioria dos novos compostos demonstrou maior atividade antiproliferativa que o ácido asiático. Alguns dos derivados exibiram valores de IC50 inferiores aos exibidos pela cisplatina nas células HeLa (2.28 μM), tendo apresentado, inclusive, valores de IC50 inferiores a 1 μM em várias linhas celulares. Foi estabelecida uma relação estrutura-actividade com base nos valores de IC50 determinados nas células HeLa. Os melhores compostos de cada painel foram posteriormente testados numa linha celular não tumoral (BJ) para avaliar a seletividade, tendo exibido menor toxicidade nas células não tumorais do que nas cancerígenas. De seguida, efetuou-se um estudo preliminar do mecanismo de ação responsável pelo efeito anticancerígeno dos compostos mais ativos de cada painel, 3.14, 4.29 e 5.6. Estes compostos foram avaliados relativamente ao seu efeito no ciclo celular e à sua capacidade para induzir apoptose nas células HeLa. Os três compostos induziram a paragem do ciclo celular na fase G0/G1 e morte celular por apoptose. O composto 3.14 induziu apoptose com ativação das caspases 8 e 3, clivagem do PARP, aumento dos níveis de Bax e uma redução dos níveis de Bcl-2, sugerindo o envolvimento das vias intrínseca e extrínseca no processo apoptótico. O derivado 4.29 induziu a morte celular por apoptose nas células HeLa através da ativação das caspases 9, 8 e 3. Este composto conduziu ainda a uma redução dos níveis das proteínas Bcl-2 e Bid e a um aumento dos níveis da proteína Bax. O composto 5.6 induziu apoptose nas células HeLa através de um mecanismo relacionado com activação das caspases. Por fim, verificou-se a existência de sinergismo quando as células HeLa foram tratadas simultaneamente com o composto 5.6 e com a cisplatina. Alguns dos novos derivados semissintéticos do ácido asiático preparados no decorrer deste trabalho, demonstraram efeitos anticancerígenos promissores em ensaios in vitro e justificam estudos pré-clínicos adicionais. Estes derivados podem vir a ser compostos úteis para o desenvolvimento de novos fármacos anticancerígenos.

Cancer is a leading cause of death worldwide, with an estimated 8.2 million cancer-related deaths registered in 2012. Moreover, the number of new cancer cases diagnosed each year is expected to rise significantly over the next decades. Considering that antineoplastic agents available currently in the clinic have several limitations and some serious side effects, it’s urgent the development of new chemotherapeutic agents with increased efficacy. Natural products have been an important source of leads for the development of new drugs, including new anticancer drugs. In fact, some of the most important antineoplastic agents used in the clinic are derived from natural products. Pentacyclic triterpenoids represent a large and structurally diverse class of natural products that display diverse biological activities, including anticancer activity. Because of this activity, their relatively safe profile, and readily availability in nature, pentacyclic triterpenoids are interesting compounds for the design of new leads aimed at the development of new anticancer agents. Asiatic acid is an ursane-type pentacyclic triterpenoid whose anticancer properties have been extensively studied over the last few years. This compound exhibited promising anticancer effects in both in vitro and in vivo studies. Moreover, previous studies reported that structural modification of asiatic acid backbone may improve its anticancer activity. Therefore, the aim of this project was to synthesize new semisynthetic derivatives of asiatic acid in order to improve its anticancer activity and obtain compounds that may be valuable for the development of new anticancer treatments. During this project, three panels of new semisynthetic derivatives of asiatic acid were designed and successfully synthesized. These panels include new fluorinated (3.1–3.26), A-nor (4.2, 4.5, 4.8, 4.12–4.30), amide and hydroxamic acid (5.6–5.16) derivatives of asiatic acid. The chemical structures of the new compounds were elucidated using techniques such as 1H and 13C NMR, IR, MS and HRMS. The antiproliferative activities of the new derivatives were evaluated against several tumor cell lines (HT-29, HeLa, MCF-7, Jurkat, PC-3, A-375, and MiaPaca-2), and the IC50 values were determined. The great majority of the new compounds showed improved growth-inhibitory activity compared with asiatic acid. Some of the new derivatives exhibited a lower IC50 value than that of the reference drug cisplatin (2.28 μM) in the HeLa cell line, and even showed IC50 values that were lower than 1 μM in several cancer cell lines. A structure–activity relationship was established based on the IC50 values determined in the HeLa cell line. The best compounds of each panel were further tested against a nontumor cell line (BJ), to assess selectivity, and exhibited lower toxicity toward nontumor cells than they did toward tumor cells. A preliminary study of the mechanism underlying the anticancer effect of the most active compounds of each panel, 3.14, 4.29 and 5.6, was performed. These compounds were evaluated regarding their effects on the cell cycle and their ability to induce apoptosis in HeLa cells. All three compounds arrested the cell cycle at the G0/G1 phase and induced apoptotic cell death. Compound 3.14-induced apoptosis was driven by caspases, with activation of caspases 8 and 3, cleavage of PARP, upregulation of Bax, and downregulation of Bcl-2, suggesting the involvement of intrinsic and extrinsic pathways in the apoptotic process. The derivative 4.29 induced apoptotic HeLa cell death via the activation of caspases 9, 8, and 3. This compound also induced the downregulation of the Bcl-2 and Bid proteins and the upregulation of the Bax protein. The compound 5.6 induced apoptosis through activation of caspases. Finally, a synergistic effect was observed after simultaneous treatment of HeLa cells with compound 5.6 and cisplatin. Some of the newly synthesized derivatives of asiatic acid showed promising in vitro anticancer effects and clearly warrant further preclinical evaluation. These derivatives may be useful molecules for the development of new anticancer drugs.