Preparation and Pre-clinical Evaluation of New Pentacyclic Triterpenoids

Abstract

Lung cancer is the most commonly diagnosed cancer and a leading cause of cancer-related deaths worldwide. Lung cancer can be classified as non-small cell lung cancer (NSCLC) or small-cell lung cancer (SCLC), with NSCLC being the most common type (85%). The high mortality rate for patients with lung cancer has been attributed to the difficulty in obtaining an early diagnosis, a high potential for metastasis, and relative insensitivity to chemotherapy. Despite novel therapeutic strategies, the overall 5-year survival rate in many countries remains less than 15%. These statistics highlight the need for the development of new clinical agents. Pentacyclic triterpenoids (PTs) are a large and structurally diverse group of natural products, widely present in several medicinal plants, fruits and vegetables. Medicinal plants containing PTs have been used for centuries in traditional medicine for the treatment of several diseases. Moreover, natural PTs have been extensively reported to possess a wide range of biological activities, including anticancer activity. From a biological point of view, some of the most important and active PTs include betulinic, oleanolic, glycyrrhetinic and ursolic (UA) acids. UA has interesting biological properties that could be explored for the design and synthesis of more effective anticancer derivatives. Additionally, UA can be considered as a potential lead, due to its promising multitarget anticancer activity, low toxicity and commercial availability. The main goal of this PhD thesis was to design, synthesize and evaluate new ursane derivatives as potential anti-NSCLC agents. This work followed three main semisynthetic strategies to modify the ursane scaffold. The first one involved expansion and cleavage of the A- ring, as well as introduction of N-containing groups. The second one aimed at the introduction of oximes and nitrile groups at A-ring. Finally, the third semisynthetic strategy was based on the introduction of esters (saturated or unsaturated), and of an α,β-unsaturated carbonyl system (with an endo- or exocyclic double bond) at A-ring. The novel ursane derivatives synthesized were fully characterized using IR, MS and NMR techniques, and their anticancer activity was evaluated against NSCLC cell lines. Based on the anticancer results obtained, the structure-activity relationships demonstrated that the most active compounds displayed a cleaved A-ring coupled with a secondary amide bearing a small alkyl side chain (3.17), an oxime group conjugated with a carbonyl function at A-ring (4.2), a cleaved A-ring bearing nitrile and imidazole groups (4.16), and an α,β-unsaturated ketone system with an exocyclic double bond conjugated with a heteroaromatic ring at A-ring (5.12). The most active compounds were further tested in a 3D culture model, specifically a multicellular spheroid, which is able to mimic more closely the in vivo tumor microenvironment. Importantly, even in a 3D model, compounds 3.17 and 4.2 were active albeit a slight increase in the IC50 value. The preliminary studies on the anticancer mechanism demonstrated that the newly synthetized derivatives are able to induce cell death via apoptosis, through activation of the extrinsic pathway, and to induce autophagy. Furthermore, these compounds appear to inherit the multitarget potential of UA, by affecting the levels of different proteins involved in the process of cell death. Overall, this work contributed with three new panels of novel ursolic acid derivatives with in vitro anticancer activity in 2D and 3D culture models. These derivatives can be promising candidates for the development of new anti-NSCLC agents.

O cancro do pulmão é dos tipos de cancro mais frequentemente diagnosticados e a principal causa de morte por cancro no mundo. O cancro do pulmão pode ser classificado como carcinoma pulmonar não de pequenas células (CPNPC) ou como carcinoma pulmonar de pequenas células (CPPC), sendo o CPNPC o tipo mais comum (85%). A elevada taxa de mortalidade em doentes com cancro do pulmão tem sido atribuída à dificuldade em obter um diagnóstico precoce, ao elevado potencial de formação de metástases, e à relativa insensibilidade à quimioterapia. Apesar das novas estratégias terapêuticas, a taxa de sobrevivência global aos 5 anos, em muito países, continua a ser inferior a 15%. Estas estatísticas destacam a necessidade para o desenvolvimento de novos agentes clínicos. Os triterpenóides pentacíclicos (TPs) representam um grupo de produtos naturais abundante e estruturalmente diverso, que estão presentes em várias plantas medicinais, frutas e vegetais. As plantas medicinais contendo TPs têm constituído ao longo dos séculos uma base para a medicina tradicional no tratamento de várias doenças. Os TPs naturais têm sido extensivamente estudados pela vasta gama de atividades biológicas, incluindo a atividade anticancerígena. Do ponto de vista biológico, alguns dos TPs mais importantes e ativos incluem os ácidos betulínico, oleanólico, glicirretínico e ursólico (AU). O AU tem propriedades biológicas interessantes que poderão ser exploradas para o design e síntese de novos derivados anticancerígenos mais eficazes. Além disso, o AU pode ser considerado como um potencial lead devido à sua promissora atividade anticancerígena multifuncional, à sua baixa toxicidade e à sua disponibilidade comercial. O principal objetivo desta tese de doutoramento foi o design, a síntese e a avaliação de novos derivados do tipo ursano como potenciais agentes contra o CPNPC. Este trabalho seguiu principalmente três estratégias de semissíntese para modificar a estrutura do ácido ursólico: 1) expansão e clivagem do anel A, assim como, introdução de grupos contendo o elemento azoto; 2) introdução de grupos oxima e nitrilo no anel A; 3) e introdução de ésteres (saturados ou não saturados) e de um sistema carbonilo α,β-insaturado (com dupla ligação endocíclica ou exocíclica) no anel A. Os novos derivados do tipo ursano sintetizados foram totalmente caracterizados através de técnicas de espectroscopia de infravermelho, ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa, e a sua atividade anticancerígena foi avaliada em linhas celulares de CPNPC. Com base nos resultados da atividade anticancerígena, as relações estrutura-atividade obtidas permitiram demonstrar que os compostos mais ativos exibem um anel A clivado e acoplado com uma amida secundária com uma pequena cadeia lateral alquílica (3.17), um anel A contendo um grupo oxima acoplado a um grupo carbonilo (4.2), um anel A clivado contendo um grupo nitrilo e um grupo imidazole (4.16), e um anel A com um sistema carbonilo α,β-insaturado, com dupla ligação exocíclica, conjugado com um anel heteroaromático (5.12). Os compostos mais ativos foram testados num modelo de cultura 3D (esferóide multicelular), o qual mimetiza de forma mais próxima o microambiente tumoral in vivo. De facto, mesmo num modelo 3D, os compostos 3.17 e 4.2 foram ativos, apenas com um ligeiro aumento do valor de IC50. Os estudos preliminares sobre o mecanismo de ação anticancerígena demonstraram que os novos derivados do AU induzem morte celular por apoptose, através da ativação da via extrínseca, assim como autofagia. Além disso, estes compostos parecem herdar o potencial multifuncional do AU, afectando os níveis de diferentes proteínas envolvidas nos mecanismos de morte celular. Em suma, este trabalho contribuiu com três novos grupos de derivados do ácido ursólico com atividade anticancerígena in vitro, em modelos de cultura 2D e 3D. Estes novos derivados podem ser considerados como candidatos promissores para o desenvolvimento de novos agentes anti-CPNPC.