MicroRNAs targeting Ataxin-3 mRNA in Machado-Joseph disease: from pathogenesis to therapy

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) is the most common autosomal dominantly-inherited ataxia worldwide. MJD belongs to the group of polyglutamine (polyQ) diseases, genetic disorders caused by an expansion in the number of CAG repetitions in the genes encoding for polyQ proteins. In the case of MJD, this expansion occurs in the ATXN3 gene, leading to the formation of a mutated form of ataxin-3 (mutATXN3) protein. MutATXN3 will then trigger multiple pathogenic events, many of which are still unclear, culminating in neuronal dysfunction and neurodegeneration. So far, no treatment has been developed capable of delaying or blocking the progression of the disease. Current therapeutic approaches consist mainly in the use of physiotherapy and in the pharmacological alleviation of specific symptoms. Nevertheless, promising therapeutic approaches have been recently discovered which hold great potential for the treatment of MJD. Among these, taking advantage of the RNA interference pathway (RNAi) allows the blockage of the production of disease-causing proteins therefore preventing its associated downstream toxic pathways. In fact, different studies based on the usage of the RNAi pathway in order to silence the expression of mutATXN3 have obtained encouraging results. However, none of these studies has elucidated how the endogenous RNAi pathway, particularly the microRNA (miRNA) based regulation of gene expression, is affected in MJD. Moreover, no study as evaluated whether endogenous miRNAs can be exploited as a novel therapeutic approach for MJD. For that reason, the aim of this project was to elucidate how the endogenous RNA regulatory mechanisms are involved in mutATXN3 regulation, whether this system is impaired in the context of MJD, and whether miRNA based regulation of ATXN3 could be useful as a novel therapeutic approach for MJD. In the first part of this project, described in chapter 2, we started by generating a novel lentiviral mouse model of MJD which would allow us the study of the endogenous RNA regulatory mechanisms, in particular those which mediate their functions through the three prime untranslated region (3’UTR) of mutATXN3. The in vitro and in vivo characterization of this model clearly demonstrated the robust role that this non-coding region mediates in the control of mutATXN3 expression. Moreover, through a genetic and pharmacologic approach, we found compelling evidence that endogenous miRNAs are involved in the regulation of ATXN3 through its 3’UTR. In chapter 3, we identified a set of miRNAs predicted to target ATXN3 3’UTR and evaluated their expression levels in multiple MJD models. In general, a global downregulation was observed for mir-9, mir-181a and mir-494, across different models including MJD neurons derived from patient fibroblasts and MJD transgenic mice. This raises important implications for the pathogenesis of MJD, but also opens a new opportunity for the development of a novel therapeutic approach for the treatment of MJD. Accordingly, based on the data obtained in chapters 2 and 3, in chapter 4 we took advantage of miRNA mediated regulation of ATXN3 through its 3’UTR as a gene therapy tool for the reduction of mutATXN3 levels. After developing a lentiviral-based system for efficient overexpression of mir-9, mir-181a and mir-494 in vitro and in vivo and validating the direct interaction between these miRNAs with the 3’UTR of ATXN3, we demonstrated that viral delivery of mir-9, mir-181a and mir-494 effectively reduced the levels of mutATXN3 and simultaneously ameliorated the associated neuropathology in vivo, in a lentiviral mouse model of MJD. In summary, in this thesis we have provided evidence that endogenous miRNAs play an important role in the regulation of mutATXN3 by targeting its 3’UTR and at the same time are dysregulated in MJD. Moreover, our data demonstrate that the reinstatement of the levels of endogenous miRNAs may be a promising therapeutic approach for the treatment of MJD.

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como ataxia espinocerebelosa do tipo 3 é a ataxia hereditária autossómica dominante com maior prevalência a nível mundial. A DMJ pertence ao grupo das doenças poliglutamínicas (poliQ), um grupo de doenças genéticas causadas por uma expansão no número de repetições CAG nos genes codificantes para as proteínas poliQ. No caso da DMJ, esta expansão ocorre no gene ATXN3, levando à formação de uma forma mutada da proteína ataxina-3 (ATXN3MUT). A proteína ATXN3MUT desencadeia múltiplas vias patogénicas, muitas das quais ainda não totalmente esclarecidas, que culminam em disfunção neuronal e neurodegenerescência. Até ao momento não foi ainda desenvolvido nenhum tratamento capaz de atrasar ou impedir a progressão da DMJ. Assim sendo, o tratamento de doentes com DMJ baseia-se maioritariamente no recurso a fisioterapia e ao uso de fármacos com o objectivo de diminuir a incidência de alguns sintomas específicos. Ainda assim, recentemente têm sido identificadas novas abordagens terapêuticas com bastante potencial para o tratamento da DMJ. Entre elas, a via de interferência de RNA (RNAi) permite bloquear a produção de proteínas mutadas causadoras de doenças e assim prevenir as vias fisiopatológicas a elas associadas. De facto, diferentes estudos baseados no silenciamento da ATXN3MUT através da via de RNAi, obtiveram resultados encorajadores. Ainda assim, nenhum destes estudos avaliou de que forma os mecanismos endógenos de RNAi, tais como a regulação da expressão génica por microRNAs (miRNAs), estariam alterados na DMJ. Para além disso, nenhum estudo avaliou se os miRNAs endógenos poderiam ser usados como nova estratégia terapêutica para a DMJ. Assim sendo, o objectivo deste projecto foi elucidar de que forma os mecanismos endógenos de regulação de RNA estariam envolvidos na regulação da ATXN3MUT, de que forma este sistema estaria alterado na DMJ, e se a regulação da ATXN3MUT por miRNAs poderia ser utilizada como nova abordagem terapêutica para o tratamento da DMJ. Na primeira parte deste projecto, descrita no capítulo 2, começámos por gerar um novo modelo lentiviral da DMJ que nos permitisse estudar os mecanismos endógenos de regulação de RNA mensageiro através da região 3’ não traduzida (3’UTR) da ATXN3MUT. A caracterização deste modelo in vitro e in vivo demonstrou um papel muito relevante da região não codificante 3’UTR no controlo da expressão da ATXN3MUT. Para além disso, recorrendo a uma abordagem genética e farmacológica, encontrámos evidências do envolvimento dos miRNAs endógenos na regulação da ATXN3MUT através da sua região 3’UTR. No capítulo 3, identificámos um conjunto de miRNAs tendo como alvo a 3’UTR da ATXN3 e avaliámos os seus níveis de expressão em múltiplos modelos da DMJ. Observámos uma diminuição nos níveis dos miRNAs mir-9, mir-181a e mir-494 em diferentes modelos incluindo neurónios MJD derivados de fibroblastos de doentes e em tecido de um modelo transgénico de MJD. Estes resultados não só têm importantes implicações para o conhecimento da patogénese da DMJ, como representam uma nova oportunidade para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para a DMJ. Assim sendo, tendo em consideração os resultados obtidos nos capítulos 2 e 3, no capítulo 4 tirámos partido da regulação da ATXN3MUT por miRNAs através da sua região 3’UTR para desenvolver uma nova estratégia de terapia génica visando a redução dos níveis de ATXN3MUT. Após o desenvolvimento de um sistema baseado em vectores lentivirais para a sobrexpressão de mir-9, mir-181a e mir-494 in vitro e in vivo e após validação da interacção directa entre os mesmos miRNAs com a 3’UTR da ATXN3, demonstrámos que a entrega destes miRNAs num modelo lentiviral da DMJ em murganho levou a uma diminuição dos níveis de ATXN3MUT e simultaneamente a uma diminuição da neuropatologia associada. Em conclusão, nesta tese demonstrámos que os miRNAs endógenos não só desempenham um importante papel na regulação da ATXN3MUT através da sua região 3’UTR, como também estão desregulados na DMJ. Para além disso, os nossos resultados demonstram que a reposição dos níveis destes miRNAs é uma promissora estratégia terapêutica para o tratamento da DMJ.