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https://hdl.handle.net/10316/32361
Title: | Therapeutic Targeting of CNS Hemangioblastomas in VHL disease | Authors: | Metelo, Ana Margarida Martins | Orientador: | Iliopoulos, Othon Castro, Margarida |
Keywords: | VHL disease; CNS tumors; hemangioblastomas; targeted therapy; somatic mutations | Issue Date: | 23-Mar-2017 | Citation: | METELO, Ana Margarida Martins - Therapeutic targeting of CNS hemangioblastomas in VHL disease. Coimbra : [s.n.], 2017. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/32361 | Project: | info:eu-repo/grantAgreement/FCT/SFRH/SFRH/BD/70002/2010/PT | Abstract: | Hemangioblastomas (HBs) são tumores benignos muito vascularizados que se desenvolvem em localizações específicas do Sistema Nervoso Central (SNC), maioritariamente no cerebelo, no tronco cerebral, ao longo da espinal medula e na retina. Estes tumores cerebrais são raros e estão muitas vezes associados à doença genética de VHL. Oitenta por cento destes pacientes desenvolvem vários HBs ao longo da sua vida, por vezes sequencialmente ou mesmo simultaneamente. O único tratamento recomendado é a remoção cirúrgica destes tumores cerebrais; contudo, devido à sensibilidade das áreas afectadas, este procedimento é muitas vezes dificultado ou mesmo impossibilitado. Actualmente, existe uma falta de estudos científicos e de modelos experimentais nesta área que permitam estudar a biologia dos HBs, o que compromete directamente o estudo das causas moleculares da doença e a descoberta de fármacos inovadores. Deste modo, os objectivos desta tese doutoral são a identificação de novos alvos terapêuticos em HBs do SNC, o teste de potenciais novos fármacos num modelo peixe-zebra (Danio rerio) da doença de VHL e, finalmente, o desenvolvimento de um novo modelo animal de ratinho para estudar a biologia destes intrigantes tumores cerebrais.
A partir de amostras humanas de HBs do SNC, procedeu-se à sequenciação completa do exoma tumoral através de técnicas inovadoras de sequenciação de “nova geração”, de forma a identificar mutações genéticas características das células tumorais de HB. Através destes resultados, descobriu-se que a inactivação de ambos os alelos do gene de VHL ocorre em todos os tumores e é necessária para o desenvolvimento tumoral. Este processo ocorre através de vários mecanismos genéticos que afectam ambos os alelos do gene de VHL incluindo: mutações génicas de substituição, mutações génicas de perda de nucleótidos ou perda do cromossoma 3 (onde se localiza o gene de VHL). Outras alterações detetadas no cariótipo das células tumorais incluem a perda do cromosoma 8, que foi detectada pela primeira vez em duas amostras de HB. Finalmente, foi identificada uma mutação oncogénica de substituição no gene PNPLA3, que origina um codão de terminação prematuro (mutação de substituição “sem sentido”). Esta mutação específica leva à perda da função enzimática da proteína PNPLA3, causando uma diminuição na quantidade de vacúolos lipídicos característicos das células tumorais VHL-/-. A diminuição nos níveis da proteína PNPLA3 é na verdade uma característica recurrente de células VHL-/-, ocorrendo não só em células tumorais de HB mas também em células tumorais de carcinoma renal. Finalmente, foi demonstrado que a diminuição dos níveis da enzima PNPLA3 especificamente em células VHL-/- promove a via de sinalização tumorigénica dependente de HIF2α e leva a um crescimento seletivo das células cancerígenas em condições metabólicas específicas.
Uma das características dos HBs do SNC é o aumento patológico dos factores de transcrição HIF e a activação das respectivas vias de signalização como consequência de mutações no gene VHL. Deste modo, inibidores do oncogene HIF2α foram testados num modelo peixe-zebra (Danio rerio) da doença de VHL como potencial estratégia inovadora para o tratamento desta doença. O modelo animal usado é o único actualmente disponível para estudar a doença de VHL e mimetiza muitos dos fenótipos observados em pacientes com esta doença. Estes embriões peixe-zebra com mutação no gene vhl desenvolvem uma extensa vascularização e angiogénese no cérebro e na retina, defeitos no processo de hematopoiese, proliferação anormal das células epiteliais do rim, anomalias cardíacas e edema generalizado. Neste estudo, foi demonstrado que o tratamento de embriões vhl-/- com o inibidor de HIF2α designado “composto 76” melhora significativamente as anomalias identificadas nestes animais, incluindo os
processos angiogénico e hematopoiético, o rendimento cardíaco e ainda a sobrevivência dos embriões vhl-/-. Finalmente, foi também mostrado que os fenótipos observados neste modelo animal são causados directamente pelo oncogene HIF2α, e não pela sua isoforma (denominada HIF1α), sendo que o inibidor “composto 76” é específico para o alvo HIF2α e inibe unicamente as suas proteínas homólogas epas1a e epas1b presentes no peixe-zebra.
De modo a expandir o material científico para estudo dos HBs do SNC, foram estabelecidas culturas de células a partir de biópsias de tumores de hemangioblastoma. Estas culturas celulares são bastante heterogéneas e expressam marcadores celulares característicos de células tumorais de HB, tais como as proteínas PDPN, VEGFα e HIF. Injeções ortotópicas destas células no cérebro de ratinhos imunosuprimidos levaram ao desenvolvimento de tumores cerebrais que mimetizam as características dos HBs do SNC em humanos, como por exemplo a histologia do tumor, o seu comportamento benigno e não-invasivo, a captação de agentes de contraste usados em resonância magnética de imagem e, finalmente, a acumulação de lípidos intracelulares. Estas características provam que este modelo de ratinho mimetiza a doença em humanos e deve ser usado para o estudo de HBs do SNC.
Em suma, o trabalho doutoral aqui apresentado levou aos seguintes resultados científicos: 1) identificação de uma nova mutação no gene PNPLA3 em tumores de HB; 2) validação de um composto terapêutico inibidor da proteína HIF2α para o tratamento dos fenótipos associados à doença de VHL num modelo de peixe-zebra; 3) desenvolvimento do primeiro modelo tumoral de HB em ratinho, o que será essencial para o estudo da biologia destes tumores cerebrais e para o teste de potenciais estratégias terapêuticas.............................................................Central Nervous S
ystem Hemangioblastomas
(CNS HBs)
are benign and highly
vascular tumors that
arise most frequently in the cerebellum, brainstem, spinal cord and retina. These rare tumors are usually
associated with the familial VHL disease
,
and eighty percent of VHL patients develop sequential
or
simultaneous
HBs throughout t
heir life.
The only effective treatment for these lesions is surgery, which
can be
extremely challenging or impossible
to perform
due to the
sensitive
location of these tumors.
The
lack of scientific studies and experimental resources to study this tumor t
ype
strongly compromises t
he
understandi
ng of the disease and
the
discovery of effective treatments.
The main goal
s
of this doctoral
work
are the
identi
fication of
novel
therapeutic targets for CNS HBs,
the
test
ing
of
potential treatments
in
a
zebrafish
mo
del
of VHL disease
and
the
establishment of
a novel
HB mouse
model
to clarify
intriguing
questions regarding the biology
and cell of origin
of HBs.
Taking advantage of HB human samples, we performed
next
-
generation
whole
-
exome sequencing
to
discover the ma
in genetic alterations
that occur in HB tumor cells.
We discovered that complete
inactivation of the
VHL
gene is necessary for HB formation. The inactivation of this gene occurred
in
both alleles
for all
tumors
through germline mutation
s
, copy
number loss
of chromosome 3,
somatic point
mutation
s and point
deletion
s
.
Loss of chromosome 8 was
also
detected in two out of eight samples.
I
n
addition, we identified
and confirmed
a nonsense mutation
in the
PNPLA3
gene
.
This
specific
mutation
leads to
loss
of
the
a
cyl
-
transferase
activity
of the protein
,
diminishing
the
accumulation of
lipid droplet
s
characteristic of VHL
-
/
-
cells
.
Furthermore, w
e showed that d
own
regulation of PNPLA3 is a
recurrent
event in
VHL
-
associated tumors that occurs
in both
CNS HBs and clear
cel
l renal cell carcinomas
.
Finally, we demonstrated that low levels of PNPLA3 in VHL
-
/
-
cancer cells
stimulate oncogenic HIF
2α
signaling and promote
a
selective
growth advantage
in metabolic stress conditions.
Considering that
disrupted
VHL
-
HIF signaling
is a hallmark of CNS Hemangioblastomas, we tested
novel
HIF2α
small
-
molecule inhibitors as an innovative targeted
strategy
fo
r the treatment
of VHL
-
/
-
tumors.
We used the only animal model of VHL disease that faithfully recapitulate
s
the human
phenotype
s
, which is the
vhl
-
/
-
zebrafish embryo.
These embryos develop pathologic angiogenesis with
hypervascularization in the brain an
d in the retina
mimicking CNS HBs
, abnormal hematopoiesis, renal
proliferation, cardiac abnormalities and severe edema. Treatment with
the
HIF2α
inhibitor compound 76
ameliorates the pathologic vessel proliferation and
abnormal
hematopoiesis,
improves t
he
cardiac output
and partially rescues
the survival of
vhl
-
/
-
embryos
.
Moreover, w
e showed that
the
VHL phenotype is
specifically driven by
H
IF2α
and not
HIF1α
, and
these compounds specifically inhibit
E
pas1a
and E
pas1b, which are the
zebrafish
homologues of the human
HIF2α.
In order to expand the
scientific
resources to study
CNS
HBs we established
HB tumor
-
derived cell
cultures
.
The
highly h
eterogeneous
polyclonal populations
express HB
tumor cell
markers such
as
PDPN
,
VEGF
α
and HIF
.
O
rthotopic injections of these
HB
-
derived cells
in the brain of immunocompromised
mice
generate
proliferative
brain tumors
that
recapitulate several features of
the human CNS HBs
,
including their cellular
histology
and benign profile, the
strong uptake of MRI contrast
agents and the
high lipid content.
These characteristic
s
highlight the potential of this model t
o study
the HB disease
.
In summary, t
his
doctoral
w
ork
led to
: i)
the identification of a novel mutation
in CNS HBs,
ii) the
validation of
HIF2α
inhibitors
for the treatment of
VHL
-
associated phenotypes
,
and
iii) the establishment
of
an unique mouse
model
crucial for the
study of CNS HB
biology
and
specific therapeutic strategies. Central Nervous System Hemangioblastomas (CNS HBs) are benign and highly vascular tumors that arise most frequently in the cerebellum, brainstem, spinal cord and retina. These rare tumors are usually associated with the familial VHL disease, and eighty percent of VHL patients develop sequential or simultaneous HBs throughout their life. The only effective treatment for these lesions is surgery, which can be extremely challenging or impossible to perform due to the sensitive location of these tumors. The lack of scientific studies and experimental resources to study this tumor type strongly compromises the understanding of the disease and the discovery of effective treatments. The main goals of this doctoral work are the identification of novel therapeutic targets for CNS HBs, the testing of potential treatments in a zebrafish model of VHL disease and the establishment of a novel HB mouse model to clarify intriguing questions regarding the biology and cell of origin of HBs. Taking advantage of HB human samples, we performed next-generation whole-exome sequencing to discover the main genetic alterations that occur in HB tumor cells. We discovered that complete inactivation of the VHL gene is necessary for HB formation. The inactivation of this gene occurred in both alleles for all tumors through germline mutations, copy number loss of chromosome 3, somatic point mutations and point deletions. Loss of chromosome 8 was also detected in two out of eight samples. In addition, we identified and confirmed a nonsense mutation in the PNPLA3 gene. This specific mutation leads to loss of the acyl-transferase activity of the protein, diminishing the accumulation of lipid droplets characteristic of VHL-/- cells. Furthermore, we showed that downregulation of PNPLA3 is a recurrent event in VHL-associated tumors that occurs in both CNS HBs and clear cell renal cell carcinomas. Finally, we demonstrated that low levels of PNPLA3 in VHL-/- cancer cells stimulate oncogenic HIF2α signaling and promote a selective growth advantage in metabolic stress conditions. Considering that disrupted VHL-HIF signaling is a hallmark of CNS Hemangioblastomas, we tested novel HIF2α small-molecule inhibitors as an innovative targeted strategy for the treatment of VHL-/- tumors. We used the only animal model of VHL disease that faithfully recapitulates the human phenotypes, which is the vhl-/- zebrafish embryo. These embryos develop pathologic angiogenesis with hypervascularization in the brain and in the retina mimicking CNS HBs, abnormal hematopoiesis, renal proliferation, cardiac abnormalities and severe edema. Treatment with the HIF2α inhibitor compound 76 ameliorates the pathologic vessel proliferation and abnormal hematopoiesis, improves the cardiac output and partially rescues the survival of vhl-/- embryos. Moreover, we showed that the VHL phenotype is specifically driven by HIF2α and not HIF1α, and these compounds specifically inhibit Epas1a and Epas1b, which are the zebrafish homologues of the human HIF2α. In order to expand the scientific resources to study CNS HBs we established HB tumor-derived cell cultures. The highly heterogeneous polyclonal populations express HB tumor cell markers such as PDPN, VEGFα and HIF. Orthotopic injections of these HB-derived cells in the brain of immunocompromised mice generate proliferative brain tumors that recapitulate several features of the human CNS HBs, including their cellular histology and benign profile, the strong uptake of MRI contrast agents and the high lipid content. These characteristics highlight the potential of this model to study the HB disease. In summary, this doctoral work led to: i) the identification of a novel mutation in CNS HBs, ii) the validation of HIF2α inhibitors for the treatment of VHL-associated phenotypes, and iii) the establishment of an unique mouse model crucial for the study of CNS HB biology and specific therapeutic strategies. |
Description: | Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra | URI: | https://hdl.handle.net/10316/32361 | Rights: | embargoedAccess |
Appears in Collections: | FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento |
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