Zebrafish anesthesia and potential implications in research : ketamine anesthesia and its influence in the development of zebrafish central nervous system

Abstract

O uso do peixe Zebra (Daniorerio) como organismo modelo em ciência aumentou significativamente na última década, devido às vantagens que acarreta: complete os estudos celulares e é menos complexo que outros modelos animais, como os roedores. É barato, reproduz-se frequentemente e em grande número, é fácil de manipular, desenvolve rápida e externamente, o que juntando à sua transparência permite um estudo detalhado e não invasivo do seu desenvolvimento. Levanta menos questões éticas e, devido à elevada homologia com o Humano, os seus resultados podem ser extrapolados. No entanto, investigação direcionada para o bem-estar animal e refinamento de técnicas não foi muito abordada. O desconhecimento dos efeitos secundários de procedimentos rotineiros, tal como anestesia, pode introduzir uma variável indesejável nos estudos, comprometendo a interpretação dos resultados. Assim, a compreensão dos efeitos secundários dos anestésicos e a procura de uma alternativa adequada, é uma necessidade corrente na investigação em peixe zebra. A cetamina é um anestésico comumente usado na medicina veterinária e em pediatria e constitui uma alternativa à anestesia atualmente usada. Não obstante, os seus efeitos no neurodesenvolvimento são contraditórios e a sua segurança não é clara. Uma compreensão do mecanismo celular em resposta aos anestésicos no sistema nervoso central é necessária para melhorar o bem-estar animal e também diminuir a variabilidade introduzida nas experiências. Tendo em conta a falta de segurança da anestesia usada em peixe zebra e a necessidade de refinamento da técnica, o presente estudo tem como objetivo estudar as alterações celulares resultantes da administração de cetamina no sistema nervoso central deste ciprinídeo, durante o seu desenvolvimento. Uma administração pontual e uma exposição contínua (24h) foram testadas, em três concentrações diferentes, em três estádios de desenvolvimento do peixe zebra. Os grupos tratados foram recolhidos a diferentes horas, e vários parâmetros foram analisados. A proliferação celular foi avaliada por dois métodos: a expressão de PCNA por westernblot e imunohistoquímica e a incorporação de BrdU através de um ensaio colorimétrico. Ambos os ensaios revelaram não haver diferenças significativas na proloferação celular nos grupos tratados com cetamina, em comparação ao grupo controlo. Apoptose, autofagia, pluripotência e organização do citoesqueleto foram igualmente avaliadas mas, devido a dificuldade técnicas, não foram obtidos resultados. Assim, apesar de os resultados sugerirem que a cetamina não afeta a proliferação celular, mais estudos para avaliar a apoptose e diferenciação celular em resposta à cetamina são necessários para entender o papel do anestésico no desenvolvimento do sistema nervoso central e a sua potencial segurança no uso em peixe zebra.

The use of Zebrafish as a model organism in scientific laboratories has increased in the past years. It has many advantages: bridges the gap between cellular models and complexes animal models, it is less expensive, easy to handle and generates large offspring. Additionally has a rapid development that occurs ex vivo which accompanied by its transparency allow complete, noninvasive developmental studies. Moreover, the use of Zebrafish raises less ethical questions, and its outcomes can be safely extrapolated to humans, due to high homology. However, investigation regarding its welfare and refinement techniques has not been much explored. The unknowing of side effects of regular procedures such as anesthesia can introduce an undesired variable into the studies, hence compromising result interpretation. Clarifying the secondary effects of anesthetics and finding a safe, adequate alternative to current ones is a necessity in zebrafish research. Ketamine is a widely used anesthetic in veterinary and pediatrics, and therefore it could constitute an option in Zebrafish research. Nevertheless, the results regarding its effects in neurodevelopment are contradictory and its safeness is not clear. A correct understanding of the cellular pathways induced by this anesthetic, in the central nervous system is needed in order to improve animal wellbeing and to decrease variability in results obtained. Considering that currently there is not a completely safe anesthetic and that refinement of anesthesia is a need in health sciences research, the present study aims to assess the cellular alterations induced by ketamine in the central nervous system of Zebrafish during development. Zebrafish were exposed to different concentrations of ketamine at different stages of development and were then collected and analyzed at different periods of time. Upon collection, animals were used to evaluate cell proliferation by two different methods: BrdU incorporation and Proliferation Cell Nuclear Antigen (PCNA) detection using immunohistochemistry and western blot. In order to study apoptosis, the DNA degradation, was assessed, the expression of caspase-3 and the expression of the apoptosis inducing factor (AIF) were evaluated by western blot and immunohistochemistry. To study autophagy, the expression of microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 was evaluated by western blot and immunohistochemistry. The results suggested that none of the ketamine concentrations altered the cell proliferation. This effect seemed to be independent of the embryo development stage. The study of the PCNA expression by immunohistochemistry also showed that the cell proliferation was restricted to specific areas such as: dorsal telencephalic proliferation zone, tectal proliferation zone and mesencephalic lamina in the mesencephalon, and cerebellum. Due to several technical difficulties it was not possible to accomplish the study of apoptosis nor of autophagy. Considering the results regarding cell proliferation, and the importance of ketamine in anesthesia it is important, in a near future, to evaluate the molecular mechanism associated to the maintenance of the cell proliferation, namely the role of neural stem cells. In addition, it is important to clarify the occurrence of apoptosis and autophagy and its role in the maintenance of the cellular proliferation and/or remodeling of the CNS upon the exposition to ketamine.