Role of miR-29b in the regulation of progranulin and dna methyltransferases 3A and 3B expression : therapeutic potential in glioblastoma

Abstract

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e mais agressivo nos adultos. Apesar de se terem feito recentemente grandes avanços no sentido de identificar mecanismos genéticos e moleculares desregulados em GBM e responsáveis por impulsionar o desenvolvimento e progressão deste tipo de tumor, a esperança média de vida dos pacientes afetados continua muito baixa, não se tendo registado melhorias significativas nos últimos anos. O tratamento convencional, na sua maioria paliativo, consiste numa terapia combinada que incluiu a remoção cirúrgica da massa tumoral principal, seguida de radioterapia e quimioterapia com o agente quimioterapêutico temozolomide (TMZ). No entanto, apesar de ser bastante agressiva, esta abordagem terapêutica é pouco eficiente e o tumor reaparece na maioria dos casos. De facto, a grande capacidade proliferativa e invasiva das células tumorais de GBM, aliadas à heterogeneidade celular e acima de tudo à elevada capacidade de resistência à apoptose, resultam na falha do tratamento e apenas conferem um tempo médio de vida que varia entre os 12 e 15 meses após o diagnóstico. Assim, é urgente o desenvolvimento de novas terapias que visem não só o atraso na progressão tumoral e o aumento da sobrevivência média de pacientes com GBM, mas também a redução dos efeitos secundários tão comuns neste tipo de tratamentos anticancerígenos. A recente identificação de uma subpopulação de células tumorais que expressam o marcador CD133 e que apresentam propriedades comuns a células estaminais, abriu novas portas para melhor compreender a patogénese deste tumor cerebral e, acima de tudo, estabeleceu um novo alvo terapêutico para terapias mais eficientes e seletivas. Estas células apresentam uma capacidade replicativa ilimitada, assim como a capacidade de se diferenciarem em todos os tipos de células que constituem a massa tumoral principal. Para além disso, esta população é altamente resistente às terapias convencionais. Desta forma, o desenvolvimento de uma terapia direcionada para estas células estaminais de glioblastoma (GSCs) poderá constituir a chave para uma completa erradicação do tumor, evitando assim, a recorrência do mesmo. Aliada a esta descoberta, os microRNAS cuja expressão se encontra desregulada em GBM, têm emergido com reguladores da iniciação e progressão deste tipo de tumor, desempenhando papeis essenciais numa vasta gama de processos biológicos, que vão desde a proliferação celular, invasão e migração, resistência à apoptose, até à manutenção das propriedades das

9 células estaminais de GBM. Estas observações sugerem que a modulação da expressão de certos miRNAs poderá também ser uma possível abordagem terapêutica para o tratamento do GBM. Neste estudo, o nosso principal objetivo foi isolar e caracterizar GSCs, isoladas a partir de uma linha primária e de uma linha recorrente de GBM, U87MG e DBTRG-05MG, respetivamente, com base na expressão de CD133, um marcador de superfície, assim como avaliar a expressão do microRNA- 29b, um microRNA supressor tumoral relacionado com alterações epigenéticas em GBM e com a potenciação de fenómenos de migração e invasão. Decidimos ainda investigar se uma modulação da expressão deste microRNA era capaz de sensibilizar as células tumorais para a ação da quimioterapia e qual seria os seu impacto na extensão de metilação global do DNA. Os resultados obtidos demonstraram que as células CD133+ isoladas a partir da linha DBTRG exibem um fenótipo de estaminalidade mais pronunciado em comparação com a mesma subpopulação isolada da linha U87. Para além disso, expressam menos miR-29b, o que pode ser inversamente correlacionado com a expressão de progranulina, das DNA metiltransferases 3A e 3B e do fator de transcrição Ying Yang 1, sendo estas proteínas alvos validados deste microRNA. Os nossos resultados mostraram ainda que o miR-29b se encontra subexpresso em ambas as frações CD133+ e CD133- isoladas das duas linhas celulares, em comparação com astrócitos humanos. O restabelecimento dos níveis de miR-29b, usando um reagente comercial como vetor de entrega do microRNA às células tumorais, sensibilizou as duas linhas celulares para os efeitos citotóxicos causados pelo sunitinib e axitinib, dois inibidores de tirosina cinase que estão em fase II de ensaios clínicos para avaliação do seu potencial como agentes quimioterapêutico para o tratamento do GBM. No entanto, a modulação do miR-29b pareceu não surtir efeitos quando combinada com a administração de temozolomide às células. Por fim, sobreexpressão do miR-29b resultou numa redução dos níveis de metilação global do DNA nas células DBTRG, enquanto que na linha U87 já não se verificou nenhum efeito ao nível do conteúdo de 5-metilcitosina. No geral, os resultados obtidos neste estudo sugerem que o microRNA 29b desempenha um papel crucial na progressão do GBM e, como tal, o desenvolvimento de uma terapia baseada no restabelecimento dos seus níveis de expressão poderá revelar-se uma abordagem eficiente para o tratamento do GBM.

Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor. Despite recent advances in the identification of genetic and molecular alterations that drive GBM pathogenesis, patient outcome has not significantly improved over the last decade. Standard treatment consists in a combined therapy, which includes surgical resection followed by radiotherapy and concomitant or adjuvant chemotherapy with temozolomide. However, despite being aggressive, this approach lacks efficiency mainly due to the rapid and infiltrative growth of tumor cells, their resistance to apoptosis and extensive cellular heterogeneity, which result in a median survival time of only 12 to 15 months from the time of diagnosis. Therefore, there is an urgent need to develop new therapeutic options that aim not only to delay tumor progression and improve the overall survival of each patient, but also reduce the side effects common to most anti-cancer treatments. The recent identification of a CD133+ subpopulation of cells, within the tumor mass, that exhibit stem-like properties, such as unlimited replicative potential and the ability to differentiate and give rise to the bulk of tumor, both in vitro and in vivo, opened new doors to a better understanding of GBM pathogenesis and established a new promising target for more effective therapies. Targeting these cells is now believed to be the key approach to a complete tumor eradication, since they are largely responsible for the acquired resistance to standard radio- and chemotherapy that often results in tumor recurrence. In addition, deregulated microRNAs are also emerging as important regulators of gliomagenesis, playing key roles in many biological processes that drive tumor initiation and progression, including cell proliferation, invasion and migration, resistance to apoptosis, and maintenance of glioblastoma stem-like cells properties (GSCs), thus suggesting that gene therapy approaches based on miRNA modulation might represent an effective therapeutic strategy for GBM treatment. In this work, our major goal was to isolate and characterize CD133+ GSCs isolated from both a primary and a recurrent human GBM cell lines, U87MG and DBTRG-05MG, respectively, and further evaluate their expression profile concerning miR-29b, a tumor suppressive miRNA closely related to aberrant epigenetic mechanisms, as well as GBM enhanced cell migration and invasion. We also proposed to modulate the expression of miR-29b and investigate whether this strategy could sensitize GBM cells to chemotherapy and impact global DNA methylation status. The obtained results demonstrated that DBTRG CD133+ cells, isolated by magnetic cell sorting, exhibit a more pronounced stem phenotype, and express less miR-29b in comparison with the CD133+ fraction isolated from U87 cells. Also, miR-29b expression could be inversely correlated with the expression of progranulin, DNA methyltransferases 3A and 3B, as well as the transcription factor Ying Yang 1, which constitute validated targets of this microRNA. In addition, we further confirmed that miR-29b expression is downregulated in both CD133- positive and negative fractions isolated from the two GBM cell lines, as compared to human astrocytes. Reestablishment of miR-29b expression levels, using a commercial reagent as a delivery vector, enhanced cell sensitivity of both U87 and DBTRG cells to the cytotoxic effects of sunitinib and axitinib, two tyrosine kinase inhibitors currently under phase II clinical trials for GBM treatment, but failed to show any effect when combined with the standard treatment drug temozolomide. Furthermore, miR-29b modulation also resulted in a decrease in the global DNA methylation status of DBTRG cells, evaluated through quantification of 5-mC levels, while showing no visible effect in U87 global DNA methylation signature. Overall our results suggest that miR-29b might play a crucial role in GBM progression, and therefore, development of a targeted therapy based on reestablishment of its expression levels might prove to be an effective approach towards GBM treatment.