Autosomal dominant optic atrophy type 1 : study of 4b and 5b exons of OPA1 gene contribution

Abstract

A atrofia óptica autossómica dominante (ADOA) é uma neuropatia óptica hereditária que foi descrita pela primeira vez no final do século XIX. A ADOA é uma doença rara, apresentando uma prevalência que varia consoante a localização geográfica. Na Dinamarca, é possível encontrar uma prevalência superior ao resto do mundo, sendo de 1:10.000. Caracteriza-se pela perda insidiosa da visão, desde moderada a grave, com início na infância. A forma sindrómica desta doença, apesar de ser rara, pode estar associada a consequências mais graves, como por exemplo ataxia, surdez, miopatia, neuropatia, entre outras. O gene OPA1 está localizado no braço longo do cromossoma 3 (3q28-29), tendo sido identificadas mais de 200 mutações em doentes com ADOA, das quais 27% são missense, 27% são uma forma alternativa de splicing, 23% são frameshift, 16,5% são nonsense e 6% devem-se a rearranjos pontuais ou cromossómicos. Este gene codifica para 8 isoformas proteicas diferentes, devido a splicing alternativo, existindo variações na sua expressão nos diferentes tecidos. Muitos investigadores consideram que os exões alternativos 4b e 5b não codificam para a proteína responsável pelo fenótipo de ADOA. No entanto, foi possível determinar através de estudos funcionais, que estes dois exões parecem ser muito importantes para a função da proteína Opa1 na manutenção da mitocôndria, para além de definirem as suas 8 isoformas. Esta proteína caracteriza-se por ter dez domínios: um domínio GTPase, um domínio intermédio, um domínio GTPase effector (GED), um domínio de importação para a mitocôndria (MIS) na região N-terminal, três domínios transmembranares (TM1, TM2a e TM2b) e três domínios coiled-coil (CC-0, CC-I e CCII). A proteína Opa1 tem um local de clivagem, em que o domínio MIS é removido após importação para a mitocôndria, e pode ter dois locais de clivagem extra localizados nos exões 5 e 5b, podendo originar uma forma longa ou duas formas curtas. Assim, o processo de splicing pode dar origem a várias isoformas e através de vários processos proteolíticos, pode originar várias formas longas e/ou várias formas curtas, podendo estas interagir de forma diferente na mitocôndria. O estudo genético do presente trabalho foi realizado em 12 amostras de DNA de doentes com suspeita clínica de ADOA. O procedimento laboratorial incluiu PCR com primers específicos para os exões alternativos 4b e 5b, seguido de electroforese em gel de agarose, purificação com ExoSAP, sequenciação pelo método de Sanger dos fragmentos purificados, purificação dos produtos de sequenciação por precipitação com etanol, electroforese capilar dos produtos de sequenciação purificados e análise dos resultados da sequenciação utilizando os programas Sequencing Analysis v5.4 e SeqScape® Software v2.5. Após a análise dos exões alternativos 4b e 5b, e das respectivas regiões adjacentes, não foi identificada nenhuma variação de sequência. Deste modo, confirmou-se que estes exões apresentam raras variações de sequência, sendo extremamente conservados entre os primatas, assim como toda a proteína. De modo a determinar a conservação evolutiva dos exões 4b e 5b do gene OPA1 e da proteína Opa1, procedeu-se ao alinhamento das sequências de nucleótidos dos exões alternativos 4b e 5b, e dos aminoácidos constituintes da proteína Opa1 utilizando as sequências de várias espécies de primatas, vertebrados e invertebrados. Assim, tendo em conta os dados obtidos, foi possível confirmar que os exões em estudo deverão ter uma função primordial uma vez que após o estudo de 12 amostras de indivíduos com ADOA não foi encontrada uma única variação de sequência. A importância dessa função nos primatas é reforçada pela elevada homologia entre espécies. Apesar de não ser possível refutar a hipótese de estes exões alternativos não contribuírem para o fenótipo ADOA, a sua análise não deve ser descurada e deve ser parte integrante do estudo do gene OPA1.

Autosomal Dominant Optic Atrophy Kjer type (ADOA) is a hereditary optic neuropathy described for the first time in the end of the XIX century. ADOA is a rare disorder with a variable prevalence according to the geographical localization. In Denmark, it is possible to find a higher prevalence (1:10,000) than in the rest of the world. It is characterized by insidious vision loss, from moderate to severe, initiating in childhood. Syndromic ADOA may be associated with more severe features, such as ataxia, deafness, myopathy, neuropathy, among other. OPA1 gene is located in the long arm of chromosome 3 (3q28-29), with more than 200 mutations identified in ADOA patients, 27% of them are missense, 27% are a form of alternative splicing, 23% are frameshift, 16.5% are nonsense and 6% are due to nucleotide or chromosomal rearrangements. This gene codes for 8 different protein isoforms due to alternative splicing, existing variation of its expression in the several tissues. Several researchers consider that alternative exons 4b and 5b are not translated in ADOA phenotype responsible protein. However, it was possible to determine by functional studies that these two exons seem to be very important for Opa1 protein in mitochondria maintenance, beyond defining its 8 isoforms. This protein has 10 different domains: a Mitochondrial Import Sequence (MIS), three transmembrane (TM1, TM2a and TM2b), three coiled-coil (CC-0, CC-I and CC-II), a GTPase, a Middle and a GTPase effector domain (GED). The Opa1 protein has a cleavage point, where the MIS domain is removed after mitochondria importation, and possibly two other extra cleavage points located in exons 5 and 5b, which may originate a long or two short isoforms. Accordingly, the splicing process may give origin to several isoforms and through several proteolytic processes, may originate several long and/or short isoforms, which may present different ways for interacting in mitochondria. This project genetic study was performed in 12 DNA samples from patients with ADOA clinical suspicion. The laboratorial procedure included PCR with specific primers for alternative exons 4b and 5b, followed with agarose gel electrophoresis, ExoSAP purification, Sanger sequencing of the purified fragments, purification of the sequencing products by ethanol precipitation, capillary electrophoresis of the purified sequencing products and analysis of the sequencing results using the Sequencing Analysis v5.4 and the SeqScape® Software v2.5 programs. After sequencing analysis of exons 4b and 5b of OPA1 gene, it was not possible to find any variant in the coding exons neither in their surrounding regions. Accordingly, it was confirmed that these exons present rare sequence variations, being extremely conserved among primates, as well as the whole protein. Aiming to determine the evolutionary conservation of OPA1 gene exons 4b and 5b, and of Opa1 protein, alignment of alternative exons 4b and 5b nucleotide sequences, and complete Opa1 protein amino acids was performed using several primates, vertebrate and invertebrate species sequences. As so, taking into consideration the obtain data, it was possible to confirm that the studied exons must have an essential role since not a single sequence variation was found after the study of the 12 samples from ADOA patients. The significance of such function in primates is reinforced by the high homology between species. Despite it is not possible to disprove the hypothesis that these alternative exons do not contribute for the ADOA phenotype, its analysis should not be neglected and should be included in the study of OPA1 gene.