Clock genes profile as disease biomarkers

Abstract

Circadian rhythms, defined by a set of biological clocks, are crucial to virtually all biological processes. A central clock is located in the hypothalamus and synchronises peripheral clocks, located in all cells. Disruptions in this complex circadian clock system, reflected by clock gene expression alterations, is associated with several diseases. Obstructive sleep apnea (OSA) is one of the most common sleep disorders. Untreated OSA has been implicated as risk factors for the development of several diseases, among which metabolic and cardiovascular disorders. However, OSA is still highly underdiagnosed, which limits its treatment. Consequently, it is urgent to find OSA biomarkers, molecular reflexes of its severity, and clock genes constitute promising candidates. Indeed, Several OSA molecular outcomes may contribute to clock genes expression alterations. In this context, the present work has three main aims: 1) to investigate the impact of OSA on peripheral clock genes, before and after treatment; 2) to find potential OSA biomarkers; 3) to evaluate the impact of neuropeptide Y (NPY) on hypothalamic clock genes. We investigated the circadian rhythm integrity of an OSA cohort, by assessing a circadian rhythm marker (body temperature) and clock genes expression (Per1-3; Cry1-2; BMAL1; CLOCK; CK1ε; DEC1-2), at four time points (8 a.m.; 11 a.m.; 4.30 p.m. and 10.30 p.m.), in peripheral blood mononucleate cells (PBMCs), before and after OSA treatment by continuous positive airway pressure (CPAP). In parallel, using a mouse hypothalamic cell line (mHypoN42), we assessed the impact of NPY on clock genes levels, at different circadian times (CTs). The results showed that OSA patients have disruptions in the typical oscillatory expression of several clock genes and abnormal clock genes messenger RNA levels. In addition, the expression of specific clock genes, at specific times, showed to correlate with OSA severity. We observed that the mRNA levels of the clock gene Cry1, at 8 a.m., have a negative correlation with OSA severity, which suggests that Cry1 has potential as a putative OSA biomarker. In hypothalamic cells, NPY changed clock genes expression, in a CT dependent manner. However, a short term constitutive expression of NPY is not sufficient to change clock genes modulation in hypothalamic cells. Thus, the expression of specific clock genes, at specific times of the day, could be used as OSA biomarkers and reflect OSA severity. Further investigations may allow a more specific and early OSA diagnosis and, consequently, a more personalized and effective treatment.

Os ritmos circadianos, definidos por um conjunto de relógios biológicos, são fundamentais para a maioria dos processos biológicos. O seu relógio central localiza-se no hipotálamo e é responsável pela sincronização dos restantes relógios periféricos, localizados em todas as células. Um funcionamento incorrecto destes relógios biológicos, demonstrado por alterações na expressão dos genes que os regulam, tem sido associado a várias doenças. A síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) é uma das perturbações do sono mais comuns. Não tratada, a SAOS constitui um factor de risco para o desenvolvimento de diversas doenças, nomeadamente doenças metabólicas e cardiovasculares. Contudo, esta é ainda uma doença altamente sub-diagnosticada, o que dificulta o seu tratamento. Desta forma, é crucial definir biomarcadores da SAOS, indicadores da sua severidade. Neste contexto, os genes reguladores dos ritmos circadianos surgem como potenciais biomarcadores uma vez que várias alterações moleculares decorrentes da SAOS poderão desencadear alterações na sua expressão. Assim, este trabalho tem três objectivos: 1) investigar o impacto da SAOS na expressão genética dos relógios periféricos, antes e depois do tratamento; 2) identificar potenciais biomarcadores da SAOS; e 3) investigar o papel do NPY na modulação dos genes relógio do hipotálamo. Consequentemente analisámos os ritmos circadianos de um grupo de doentes diagnosticados com SAOS, através de um indicador do funcionamento dos seus relógios biológicos (a temperatura corporal) e da expressão dos genes que os regulam (Per1-3; Cry1-2; BMAL1; CLOCK; CK1ε; DEC1- 2), em quatro momentos do dia (8h, 11h, 16h30 e 22h30), em células mononucleadas do sangue, antes e depois do tratamento por pressão contínua positiva nas vias aérias. Paralelamente, recorrendo a uma linha celular de hipotálamo de murganho (mHypoN42), investigámos o papel do NPY na modulação da expressão dos genes do relógio central, em diferentes tempos circadianos. Os resultados obtidos mostram que, de facto, doentes com SAOS podem ser caracterizados por alterações nos ritmos de expressão dos genes relógio, apresentando também níveis anormais de expressão. Além disso, a expressão de genes específicos, em certos momentos do dia, mostraram correlacionar-se com a severidade da SAOS. Observamos que os níveis de expressão do gene Cry1, as 8h, correlacionam-se negativamente com o índice de severidade da SAOS, podendo a expressão deste gene ser um potencial biomarcador da SAOS. Em células do hipotálamo, o NPY tem a capacidade de modular a expressão dos seus genes relógio, de uma forma dependente do tempo circadiano. No entanto, a sua expressão constitutiva, a curto prazo, não é suficiente interferir com a expressão dos principais genes reguladores do relógio central dos ritmos circadianos. Portanto, as expressóes de genes relógio específicos, em momentos do dia específicos, poderão ser usados como biomarcadores da SAOS e reflectir a sua severidade. Assim, investigações futuras poderão melhorar o diagnóstico desta perturbação do sono, tornando-o mais específico e precoce. Desta forma, um tratamento mais personalizado e eficaz poderá ser possível.