The importance of cytokinesmediated communication in CSCs’ formation

Abstract

Evidence on the dedifferentiation process and on its implication in cancer stem cells’ (CSCs) formation represents one of the most recent breakthroughs in the understanding of cancer. Our laboratory recently implicated this particular cellular population in the malignant transformation of a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B into RenG2), following a carcinogenic insult and serial rounds of injection in immunocompromised mice. Furthermore, it became evident that dedifferentiation was driven by a paracrine communication loop between malignant tumor cells and mice stromal cells due to the action of Interleukin-6 (IL-6), Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and Activin-A. The main goal of the present project was to unravel the abovementioned cytokines’ release dynamics, focusing on the involvement of exosomes. For this purpose, exosomes were isolated from the conditioned media of the co-culture of RenG2 cells with human bronchial fibroblasts (E2A), and their content was analyzed for the cytokines in study. Furthermore, fibroblast’s extracellular matrix (ECM) was isolated and co-cultured with RenG2 cells to assess the probable reservoir function previously attributed to the ECM. Additionally, the presence of exosomes in the ECM was also evaluated in order to determine if these structures are being stored in the ECM. Finally, in order to exclude a possible non-exosome mediated release of the cytokines, the co-culture conditioned media were evaluated for the presence of free cytokines. The results obtained allowed us to demonstrate that the cytokines of interest are being released by the fibroblasts in co-culture as exosomal cargo, which then lead to RenG2 cells’ dedifferentiation upon reaching these cells. Still, the ECM seems to function as a reservoir of exosomes containing the pro-inflammatory cytokines IL-6 and G-CSF; however, Activin-A is not being stored in exosomes present in the matrix, being probably produced and released in just the right extent of the cell’s needs.

Um dos mais recentes avanços na área da Oncobiologia é a crescente evidência da implicação do processo de dediferenciação na formação de células estaminais tumorais (CETs). Trabalho recente do nosso laboratório mostrou que após um insulto carcinogénico e cultura baixa densidade foi possível malignizar a linha celular de epitélio bronquial humano BEAS-2B, dando origem ao sistema celular RenG2. Posteriormente, sucessivas injeções em ratinhos imunocomprometidos permitiram a derivação do sistema e a obtenção de sistemas progressivamente mais malignos e agressivos. O estudo detalhado e comparativo destes sistemas levou à identificação de uma população de CETs no seio das células RenG2, a qual foi posteriormente mostrado ter derivado de uma comunicação parácrina estabelecida entre as células RenG2 injetadas no ratinho e os fibroblastos do compartimento subcutâneo do animal, mediada pela Interleucina-6 (IL-6), o Fator estimulador de colónias granulocitárias (G-CSF) e a Activina-A. O principal objectivo deste projeto foi determinar os mecanismos de libertação das citocinas supracitadas, com particular ênfase no envolvimento de exosomas. Com esta finalidade, o conteúdo de exosomas isolados do meio condicionado de co-culturas de células RenG2 com fibroblastos bronquiais humanos (E2A) foi analisado, e foram pesquisadas as citocinas de interesse. Para além disso, a matriz extracelular dos mesmos fibroblastos foi também isolada e co-cultivada com as células RenG2 para avaliar a provável função de reservatório previamente atribuída à matriz. Finalmente, para excluir uma libertação de citocinas não mediada por exosomas, foi também pesquisada a presença das citocinas livres nos meios condicionado das co-culturas. Os resultados obtidos permitiram mostrar que as citocinas de interesse são libertadas no interior de exosomas pelos fibroblastos em co-cultura, fundindo-se posteriormente com as células RenG2 orquestrando a sua dediferenciação. Por outro lado, a matriz extracelular parece estar a funcionar como um reservatório de exosomas contendo as citocinas proinflamatórias IL-6 e G-CSF; contudo, a Activina A não é acumulada em exosomas na matriz, sendo provavelmente produzida e libertada na medida exata das necessidades celulares.