Comparison of Extracellular Vesicles isolation protocols from the plasma of patients with multiple myeloma: size characterization, expression of EV markers and microRNAs

Abstract

Multiple myeloma (MM) is a plasma cell malignancy characterized by uncontrolled production of monoclonal immunoglobulins within the bone marrow. Despite the recent major treatment advances, obtained with the introduction of new therapeutic agents such as bortezomib and lenalidomide, drug resistance is a major obstacle to therapeutic success. Therefore, it is urgent to identify biomarkers of MM drug resistance. Extracellular vesicles (EVs) (including microvesicles and exosomes) are released by various cell types, contributing to intercellular communication. Tumor cells such as MM cells also release EVs, whose cargo may be transferred into recipient cells. Importantly, the presence of markers in the circulating EVs shed by tumor drug resistant cells, including particular microRNAs such as miR-21, may allow the detection of biomarkers of drug resistance. Therefore, this study aimed at selecting a method and optimizing a protocol for the isolation of EVs with different sizes (possibly exosomes and microvesicles) from plasma samples of MM patients. Thus, a comparison of methods was carried out, including ultracentrifugation, a commercial kit (ExoQuick) and qEV size exclusion chromatography (SEC) columns. The isolated EVs were characterized in terms of size and purity, by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM), respectively. In addition, the analysis of EV markers such as Hsp70, CD63 and CD9 was also carried out (by Western Blot), together with the detection of possible cellular contaminants and protein contaminants from the plasma. Finally, the expression levels of miR-21 and miR-16 was attempted (by qRT-PCR). All the three methods allowed the isolation of EVs, but with distinct sizes. The ultracentrifugation allowed the isolation of EVs together with contaminants (possibly lipoproteins). In addition, this protocol had the disadvantage of requiring an expensive equipment (ultracentrifuge) and taking several hours. Moreover, the amount of total protein recovered from the ultracentrifugation protocol was very low. The ExoQuick kit allowed higher yields of total protein to be recovered from the isolated EVs and it was a much quicker protocol than the ultracentrifugation one; however, it only isolated the smaller vesicles (possibly exosomes). The qEV SEC columns were the preferred approach, since they enabled a rapid isolation of EVs with various sizes (possiblyexosomes and microvesicles). In addition, by pooling the various fractions collected, it is possible to have enough protein to be analysed by Western blot. Finally, preliminary results indicate that RNAse treatment is necessary when analysing miRs from EV samples. In addition, when pre-treating samples with RNase, the three protocols seem to allow detecting similar levels of miRs. However, these preliminary results need to be confirmed before conclusions can be taken.

O mieloma múltiplo é uma neoplasia maligna caracterizada pela produção descontrolada de imunoglobulinas monoclonais na medula óssea. Apesar dos recentes avanços nos tratamentos, obtidos sobretudo com a introdução de novos agentes terapêuticos como o bortezomib e a lenalidomida, a resistência aos fármacos continua a ser um dos maiores obstáculos para o sucesso terapêutico. Assim, é urgente identificar biomarcadores de resistência em mieloma múltiplo. Vesículas extracelulares (incluindo microvesículas e exossomas) são libertadas por vários tipos celulares, contribuindo para a comunicação intercelular. Células tumorais de mieloma múltiplo também libertam essas vesículas extracelulares, que transportam no seu interior componentes que podem ser transferidos parar outras células. A presença de marcadores nas vesículas extracelulares circulantes no sangue, libertadas por células tumorais resistentes a fármacos, nomeadamente microRNAs como o miR-21, podem permitir a detecção de biomarcadores de resistência. Assim, este projecto teve o objectivo de selecionar um método e optimizar um protocolo de extração de vesículas extracelulares com diferentes tamanhos (possivelmente exossomas e microvesículas) existentes no plasma de doentes com mieloma múltiplo. Para isso, foi realizada uma comparação entre métodos, incluindo a ultracentrifugação, um kit comercial (ExoQuick) e colunas de cromatografia de exclusão por tamanho (qEV). As vesículas extracelulares isoladas foram caracterizadas em termos de perfil de tamanho e pureza, respectivamente, por “Dynamic light scattering” (DLS) e por microscopia electrónica de transmissão (TEM). Além disso, a presença de marcadores como o Hsp70, CD63 e CD9 foi também analisada (por Western blot), bem como a presença de possíveis contaminantes celulares e proteicos com origem no plasma. Por fim, a expressão de miR-21 e miR-16 foi igualmente realizada (por qRT-PCR). Os três métodos permitiram a extração de vesículas extracelulares, mas com diferentes tamanhos. A ultracentrifugação permitiu isolar vesículas extracelulares mas contendo contaminantes (possivelmente lipoproteínas). Este protocolo tem também as desvantagens de requerer equipamento dispendioso (ultracentrífuga) e de ser muito moroso. Além disso, a quantidade total de proteína conseguida com este método foi muito reduzida. Por sua vez, ExoQuick permitiu precipitar grandes quantidades de proteína total a partir de amostras de vesículas extracelulares, tendo sido ainda um protocolo muito maisrápido em comparação com a ultracentrífugação; contudo, apenas permitiu isolar vesículas de pequenos tamanhos (possivelmente exossomas). As colunas de cromatografia qEV mostraram ser o protocolo preferido, uma vez que permitiram o rápido isolamento de vesículas extracelulares com diferentes tamanhos (possivelmente exossomas e microvesículas). Além disso, juntando as várias frações recolhidas das colunas qEV, é possível obter quantidade de proteína suficiente para ser analisada por Western blot. Por fim, resultados preliminares indicaram que o tratamento com RNase é necessário para a análise de miRs a partir de amostras de vesículas extracelulares. Além disso, com o pré-tratamento das amostras com RNase, os três protocolos parecem permitir detectar quantidades semelhantes de miRs. Contudo, estes resultados preliminares precisam ser confirmados para que se possam retirar conclusões.

cancro, mieloma múltiplo, resistência aos fármacos, vesículas extracelulares, miRs