Análise do impacto de compostos poluentes na actividade neuronal

Abstract

O efeito de compostos poluentes na saúde humana é um tema de grande interesse científico a nível mundial. Devido ao aparente envolvimento de zinco e de espécies reactivas de oxigénio (reactive oxygen species, ROS) em várias doenças neurodegenerativas, este trabalho centrou-se no estudo da influência de poluentes fenólicos em variações de zinco e na formação de espécies reativas de oxigénio durante a atividade neuronal. Os estudos foram realizados em fatias cerebrais de rato, nas sinapses das fibras musgosas da área CA3 do hipocampo, que têm uma das maiores concentrações de zinco no cérebro. Variações de zinco e de ROS induzidas quimicamente ou pela adição de poluentes fenólicos foram medidas usando, respetivamente, os indicadores fluorescentes Newport Green e 2,7-diacetato-dicloro-dihidro-fluoresceina (H2DCFDA). A introdução, no meio extracelular, de poluentes fenólicos (600 mg / L) fez aumentar, de modo reversível, tanto os sinais de zinco como os de ROS, o que está de acordo com a ideia de que existe uma relação entre eles. Tanto nos estudos de zinco como de ROS, investigou-se o efeito de uma solução extracelular contendo Tetraetilamónio (TEA), um bloqueador de canais de potássio dependentes do potencial, e uma elevada concentração de cálcio, para a indução da potenciação de longa duração (long term potentiaion, LTP) química. Em ambos os casos observou-se, neste meio, uma diminuição dos sinais em causa, em relação ao nível de fluorescência basal. Esta descida era revertida na presença da solução normal de perfusão, voltando os sinais a atingir aproximadamente o valor basal. Foi também estudado o efeito dos poluentes fenólicos nos sinais de zinco e de ROS induzidos por meio da solução extracelular com TEA e mais cálcio, para a indução química da LTP. Verificou-se, em ambos os casos, que na presença dos compostos fenólicos, aqueles sinais sofrem pequenas alterações, exceto quando se volta à solução de perfusão normal, em cujo caso os sinais aumentam em relação à linha base, sugerindo a presença de maiores quantidades de zinco e de ROS. Nas experiências de zinco foram analisadas várias situações, tais como a exposição das fatias do hipocampo a KCl (60 mM), composto que provoca a despolarização da membrana celular, permitindo a saída do zinco das vesículas pré-sinápticas e a sua consequente migração para a zona pós-sináptica, originando um aumento dos sinais de zinco que se consideram ser pós-sinápticos. Foi também estudada a adição de zinco externo na presença de KCl, o que provocou um aumento maior do que na situação anterior. Isto sugere que o KCl ao despolarizar também a membrana pós-sináptica permite a entrada de zinco adicionado externamente, para a zona pós-sinática. Para os sinais de zinco, verificou-se que a adição do quelante de zinco N,N,N,N’-tetrakis (2-piridilmetil) etilenodiamina (TPEN) (100 μM) diminuiu os valores de fluorescência até ao nível basal, confirmando que estes sinais representam variações de zinco. A aplicação conjunta dos compostos nifedipina (10 μM), 2, 3-di-hidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo quinoxalina-2,3-diona (NBQX) (10 μM) e D - 2-amino-5-fosfonopentanóico ácido (D-APV) (50 μM), respetivamente bloqueador de canais de cálcio dependentes do potencial (voltage dependent calcium channels, VDCCs) e antagonistas de recetores sensíveis a ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolopropiónico/kainato (AMPA/kainato) e ao N-metil-d-aspartato (NMDA), fez diminuir a amplitude dos sinais que não atingiram a linha base, sugerindo que eles têm origem pós-sináptica. O facto dos sinais não terem diminuido completamente pode ser devido à não utilização de um antagonista de bombas Na+-Ca+, que poderão também estar envolvidas nas variações de zinco pós-sinápticas. A aplicação da mesma mistura de bloqueador e antagonistas nos estudos de ROS não originou qualquer variação, sugerindo que os sinais de ROS medidos são independentes da transmissão sináptica.

The effect of pollutant compounds on human health is a topic of great scientific interest worldwide. Due to the apparent involvement of zinc and reactive oxygen species (ROS) in various neurodegenerative diseases, this work has focused on the study of the influence of phenolic pollutants on zinc changes and on the formation of reactive oxygen species during neuronal activity. The studies were performed in rat brain slices, more specifically at the mossy fiber synapses of hippocampal CA3 area, which have one of the higher concentrations of zinc in the brain. Zinc and ROS changes induced chemically or by the addition of phenolic pollutants were measured using as fluorescent indicators Newport Green and diacetate 2, 7-dichloro-dihydro-fluorescein (H2DCFDA), respectively. The introduction of phenolic pollutants (600 mg / L) in the extracellular mediumcaused a reversible increase in both the zinc and the ROS signals, in agreement with the idea that there is a relashionship between them. In both the ROS and the zinc studies, it was investigated the effect of an extracellular solution containing TEA, a blocker of voltage dependent potassium channels, and a high concentration of calcium, for the chemical induction of long-term potentiation (LTP). In both cases it was observed, in this solution, a decrease of the signals in question in relation to the baseline fluorescence level. This decrease was reversed in the presence of the normal perfusion solution, in which the signals reached approximately the baseline. The effect of the phenolic pollutants on both the zinc and the ROS signals evoked by the extracellular solution with TEA and more calcium, for the chemical induction of LTP, was also studied. In both cases, it was found that, in presence of the phenolic compounds, there are small changes in the signals except when returning to the normal perfusion solution, in which case the signals increase with respect to the baseline, suggesting the presence of higher amounts of zinc and ROS. In the zinc experiments, several situations were evaluated, such as the exposure of hippocampal slices to KCl (60 mM) which causes a depolarization of the cell membrane, allowing the release of zinc from the presynaptic vesicles and its migration into the postsynaptic area, leading to increased zinc signals, which are belived to be postsynaptic. The addition of external zinc in the presence of KCl was also studied. This caused a greater increase than in the previous situation suggesting that the postsynaptic depolarization caused by KCl allows the entry of externally added zinc in the postsynaptic region. For the zinc signals , it was found that the addition of the zinc chelator, N, N, N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine (TPEN) (100 mM) decreased the fluorescence values to the baseline level confirming that these signals represent zinc changes. The combined application of the compounds nifedipine (10 mM), 2, 3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo-2,3-dione (NBQX) (10 mM) and D - 2-amino-5 -fosfonopentanóico acid (D-APV) (50 mM), a voltage dependent calciumchannel (VDCC) blocker and antagonists of the acid α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid / kainate (AMPA / kainate) and N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, respectively, decreased the amplitude of the signls, that did not reach the baseline, suggesting that they have a postsynaptic origin. The fact that the signals did not fully decrease may be due to not having used an antagonist of the Na+-Ca+ pumps, that may also be involved in postsynaptic zinc changes. In the ROS studies, the application of the same blocker and antagonists´s mixture, did not cause any change, suggesting that the ROS signals are independent of synaptic transmission.