Development of chitosan-based nanoparticles for nasal immunization against hepatitis B

Abstract

Vaccines are one of medicine greatest achievements, reducing the incidence of infectious diseases and eradicating otherwise fatal diseases worldwide. However, hepatitis B virus (HBV) infection is still a major global health concern and the most common cause of chronic liver disease and mortality from hepatocellular carcinoma. New generation vaccines are needed in order to overcome the limitations of the current HBV vaccines in the market. In this regard, mucosal immunization constitutes an attractive alternative to the available parenteral vaccine, especially in developing countries, since it would be best suited for mass immunization and would provide protection at the pathogen entry site. The main objective of this thesis was to develop the next generation of HBV vaccines exploiting the immunomodulatory and mucoadhesive properties of chitosan-based delivery nanoparticles. This strategy would improve not only mucosal- and cell-mediated immunity, but would also allow the vaccine to be efficiently administered through the nasal mucosa. To achieve this goal, two different approaches were developed and tested. First, a novel prototypic system combining two well-established immunopotentiators, chitosan and aluminium salts, was produced to deliver hepatitis B surface antigen (HBsAg). Adjuvant combination has been considered a promising strategy to boost immunogenicity. The second approach involved the generation of a gene delivery system consisting of complexes of human serum albumin (HSA)-loaded chitosan nanoparticles with DNA (HSA-CH NP/DNA) encoding HBsAg. The two delivery systems were characterized and evaluated, both in vitro and in vivo. In order to fulfill the main goal, we established a detailed methodology to easily obtain large quantities of endotoxin-free chitosan without modifying its immunomodulatory properties. Bacterial endotoxins content was assessed according to the recommendations of the International Council for Harmonization (ICH) guideline and validated with in vitro data. Chitosan-aluminium nanoparticles (CH-Al NPs) were prepared using a nanoprecipitation technique; the optimal formulation exhibited a mean diameter of 280 nm and a positive surface charge, showing no cytotoxic effects in two different cell lines and in a primary culture of splenocytes, in the dose used for in vivo studies. In vitro uptake studies showed that CH-Al NPs were efficiently internalized by epithelial cells, demonstrating potential as a delivery system for a wide range of model antigens. Immunization studies showed that mice subcutaneously immunized with HBsAg adjuvanted with CH NPs displayed enhanced humoral and cellular immune responses. To understand the underlying mechanisms of adjuvanticity of CH-Al NPs, the ability of CH-Al NPs to promote dendritic cell (DC) activation and their potential to stimulate innate and adaptive immune responses was assessed. Results were correlated to those obtained with chitosan in solution (CH sol.) and conventional chitosan particles (CH-Na NPs). All the formulations were capable of modulating Toll-like receptor (TLR)-9 agonist, CpG, induced cytokine secretion in bone-marrow derived dendritic cells (BMDCs) and induced DC maturation in the absence of cytokine production. After intraperitoneal (I.P.) injection, CH-Al NPs were capable of generating a local immune response comparable to that elicited by the vaccine adjuvant alum, with recruitment of neutrophils and eosinophils and concomitant disappearance of resident macrophages and mast cells. After vaccination with CH-Al NPs in combination with HBsAg, mice developed high antigen-specific immunoglobulin G (IgG) titers in the serum, as well as in nasal and vaginal washes, generating an overall improved immune profile in comparison to the commercially available vaccine Engerix-B. In the second approach, a DNA vaccine was developed in which a plasmid coding for the HBsAg was adsorbed on the surface of the HSA-loaded CH NPs. The presence of HSA enhanced transfection activity and facilitated DNA release from the complex by weakening the interaction between positively charged nanoparticles and negatively charged plasmid DNA (pDNA). To assess in vivo the value of the developed formulation, immunization studies were conducted. Nasal immunization with HSA-CH NP/DNA complexes elicited high levels of serum anti-HBsAg IgG and antigen-specific IgA in nasal and vaginal secretions, while no systemic or mucosal responses were detected after immunization with DNA alone. These results confirm the ability of this novel delivery system to generate a mucosal immune response, making it a valuable adjuvant for nasal vaccination against HBV. Overall, our findings add to our knowledge of the mechanism of action of chitosan-based formulations and illustrate that proper design is vital in order to generate an effective adjuvant for HBV vaccines, capable of driving mucosal immune responses in addition to potent humoral and cell-mediated immunity.

As vacinas são uma das maiores conquistas da medicina, reduzindo a incidência de doenças infeciosas e erradicando mundialmente doenças que outrora seriam fatais. Apesar de existir no mercado uma vacina profilática contra a hepatite B, a infeção pelo vírus da hepatite B (VHB) continua a ser um dos principais problemas de saúde pública e a causa mais comum de doença hepática crónica e mortalidade por carcinoma hepatocelular. É por isso necessário uma nova geração de vacinas que ultrapassem as limitações das vacinas contra o VHB atualmente no mercado. Nesse sentido, a imunização pelas mucosas constitui uma alternativa apelativa à vacina parentérica disponível, especialmente nos países em desenvolvimento, uma vez que seria mais adequada para imunização em massa e proporcionaria proteção no local de entrada do patogéneo, nomeadamente no caso de uma doença sexualmente transmitida. Neste sentido, o principal objetivo desta tese consiste em desenvolver a próxima geração de vacinas contra o VHB explorando as propriedades imunomoduladoras e mucoadesivas de nanopartículas à base de quitosano. Esta nova vacina melhoraria não só a imunidade ao nível das mucosas e a mediada por células, como permitiria que a vacina fosse administrada de forma eficiente através da mucosa nasal. Para atingir este objetivo, duas estratégias diferentes foram desenvolvidas e testadas. Primeiro, foi otimizado um novo sistema protótipico de liberação do antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), combinando dois imunopotenciadores bem estabelecidos, o quitosano e os sais de alumínio, uma vez que a combinação de adjuvantes tem sido considerada uma estratégia promissora para potenciar a resposta imunológica; segundo, foram também desenvolvidos complexos de nanopartículas de quitosano carregados com albumina de soro humano (HSA) e complexados com ADN (HSACH NP/ADN), usados para estimular a resposta imune sistémica e nas mucosas após administração intranasal. Os dois sistemas de libertação de moléculas ativas foram caracterizados e avaliados quer in vitro, quer in vivo. Para cumprir o objetivo principal, estabelecemos uma metodologia detalhada de modo a obter facilmente quitosano livre de endotoxinas, sem comprometer as suas propriedades bioquímicas. O conteúdo das endotoxinas bacterianas foi avaliado em conformidade com as recomendações da diretiva do Conselho Internacional de Harmonização (ICH) e validado com dados obtidos em estudos in vitro. As nanopartículas de quitosano alumínio (CH-Al NPs) foram preparadas utilizando uma técnica de nanoprecipitação; a formulação otimizada exibiu um diâmetro médio de 280 nm e uma carga de superfície positiva, não apresentando efeitos citotóxicos em duas linhas celulares diferentes e numa cultura primária de esplenócitos, para a dose utilizada posteriormente em estudos de imunização. Estudos de internalização in vitro demonstraram que as CH-Al NPs foram eficientemente internalizadas por células epiteliais exibindo potencial como sistema de libertação para uma ampla gama de antigénios modelo. Estudos in vivo mostraram que murganhos imunizados pela via subcutânea com HBsAg coadjuvado com CH NP apresentaram uma melhor resposta imune humoral e celular quando comparado com o grupo de murganhos vacinados apenas com o antigénio. Para entender os mecanismos subjacentes de adjuvanticidade das CH-Al NPs, avaliou-se a sua capacidade para promover a ativação de células dendríticas (DC), e o seu potencial para estimular respostas imunes inatas e adaptativas. Os resultados foram correlacionados com os obtidos com quitosano em solução (CH sol.) e partículas de quitosano convencionais (CH-Na NP). Todas as formulações foram capazes de modular a secreção de citoquinas induzida por agonistas dos recetores tipo-Toll (TLR)-9, CpG, em células dendríticas derivadas da medula óssea de murganho (BMDCs) e induziram a maturação de DC na ausência de produção de citoquinas. Após a injeção intraperitoneal (I.P.), as CH-Al NPs foram capazes de gerar uma resposta imunitária local comparável à evocada por sais de alumínio usado com adjuvantes em vacina que se caracterizou por recrutar neutrófilos e eosinófilos e por um desaparecimento de macrófagos e mastócitos. Após a vacinação com CH-Al NP pela via subcutânea em combinação com HBsAg, os murganhos desenvolveram títulos elevados de anticorpos IgG anti-HBsAg no soro, bem como nas lavagens nasais e vaginais, gerando um perfil imunológico melhorado em comparação com a vacina comercialmente disponível, Engerix-B. Na segunda abordagem foi desenvolvida uma vacina de ADN na qual um plasmídeo que codifica o HBsAg foi adsorvido na superfície das CH-NPs carregadas com HSA. A presença de HSA aumentou a atividade de transfecção e facilitou a libertação de ADN a partir do complexo, por enfraquecer a interação entre nanopartículas positivamente carregadas e o ADN carregado negativamente. Para avaliar o potencial da formulação desenvolvida foram conduzidos estudos in vivo. A imunização com complexos HSA-CH NP/ADN originou níveis elevados de anticorpos IgG anti-HBsAg e anticorpos IgA específicos contra o HBsAg nas secreções nasais e vaginais, enquanto não foram detetadas respostas sistémicas ou nas mucosas após imunização com ADN sozinho. Estes resultados demonstram o potencial deste novo sistema de administração em gerar uma resposta imune nas mucosas, tornando-o num adjuvante promissor para a vacinação nasal contra o HBV. De modo geral, os resultados obtidos melhoram o nosso conhecimento de formulações à base de quitosano e demonstram que o design apropriado é vital para a formular um adjuvante eficaz para vacinas contra o HBV, capaz de produzir respostas imune ao nível das mucosas além de potenciar imunidade humoral e celular.