The interaction of Giardia Lamblia with macrophage cells : the action of parasite proteases on inos, cox-2 and p65rela inflammatory proteins

Abstract

Giardia lamblia (Giardia duodenalis ou Giardia intestinalis) é um dos parasitas intestinais mais comuns do homem que causa doença gastrointestinal. Este parasita não é invasivo, mas consegue subverter/limitar a resposta inflamatória no intestino delgado permitindo a sua colonização. No entanto, o conhecimento dos mecanismos moleculares pelos quais Giardia modula as células imunitárias da mucosa intestinal, por exemplo os macrófagos, é limitado. Dado que as proteases de parasitas têm um papel importante nas interações parasita-hospedeiro, nomeadamente como efectores de mecanismos de evasão imunológica, investigamos o seu contributo nos efeitos imunomoduladores de Giardia. Para isso, estudaram-se os efeitos de extratos de G. lamblia na integridade de três proteínas chave da resposta inflamatória de macrófagos estimulados pelo LPS, iNOS, COX-2 e NF-kB p65RelA. Os níveis de iNOS, COX-2 e NF-kB p65RelA foram avaliados por Western Blot e a atividade proteolítica em extractos de parasitas foi detetada por zimografia. Os inibidores selectivos das principais classes de proteases, incluindo a cisteína, serina, aspartato e metaloproteases foram utilizados para caracterizar a atividade proteolítica. Os resultados mostraram que os extratos de G. lamblia possuem elevada atividade proteolítica, em particular sobre a subunidade NF-kB p65RelA. A zimografia detectou que os trofozoítos contêm, pelo menos, três proteases distintas: uma metaloprotease com 135 kDa, e duas proteases de cisteína com 75 e 63 kDa. Além disso, a clivagem de NF-kB p65RelA foi bloqueada principalmente por fenantrolina, E-64 e leupeptina, inibidores selectivos de metaloproteases e proteases de cisteína, respetivamente. No geral, os nossos resultados demonstram que as proteases presentes nos trofozoitos de G. lamblia estão envolvidas na inativação da NF-kB p65RelA dos macrófagos, sendo um possível mecanismo de subversão imunológica. Este conhecimento pode ser utilizado para o desenvolvimento de agentes terapêuticos que tenham como alvo proteases do parasita, permitindo, assim, o tratamento da giardíase. No entanto, são necessários mais estudos sobre o papel preciso das proteases de Giardia particularmente sobre os mecanismos pelos quais as células hospedeiras têm acesso a esses produtos de origem parasitária.

Giardia lamblia (syn. Giardia duodenalis and Giardia intestinalis) is in humans one of the most common intestinal parasites responsible for gastrointestinal disease. Although Giardia is not an invasive parasite, it dampens the inflammatory response in small intestine by yet unidentified mechanisms, allowing its effective colonization. Given that parasite proteases have been suggested to play important roles in host-pathogen interactions, namely as effectors of immune escape mechanisms we sought to investigate in this work their contribution to Giardia immunomodulatory capacities. For this we addressed the direct effects of G. lamblia extracts on the integrity of macrophage iNOS, COX-2 and NF-κB p65RelA, three key proteins of inflammatory response. The levels of iNOS, COX-2 and NF-κB p65RelA were evaluated by western blot analysis and the detection of proteolytic activities in parasite extracts was analysed by zymography. Selective inhibitors of the main classes of proteases including cysteine, serine, aspartic and metalloproteases were used in order to characterize the proteolytic activity. Our results showed that G. lamblia extracts possess high proteolytic activity, particularly over macrophages NF-κB p65RelA subunit. By zymography assays we found that Giardia trophozoites contain at least three distinct proteases: a 135 kDa metalloprotease, and two cysteine proteases with 75 and 63 kDa. Moreover, the cleavage of NF-κB p65RelA was mainly blocked by phenantroline, E-64 and leupeptin, selective inhibitors of metalloprotease and cysteine proteases, respectively. Overall our data demonstrate that the proteases present in the infective trophozoite form of G. lamblia are involved in host-cell NF-κB p65RelA inactivation, being a possible immune subversion mechanism. This knowledge may be used for the development of chemotherapeutic agents that specifically target parasite proteases allowing therefore the treatment of giardiasis. However, more studies are needed about the precise role of Giardia proteases particularly on the mechanisms by which the parasite delivers them to host cells.