The role of LSD1/CoREST during hemogenic reprogramming.

Abstract

As células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são capazes de se auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células sanguíneas. Estas características fazem com que a transplantação de HSCs seja o principal tratamento contra doenças hematológicas. A incompatibilidade entre dador-paciente e o número insuficiente de HSCs que são obtidas para transplantação limitam o sucesso deste tipo de terapia celular. De forma a ultrapassar estas limitações, a expansão destas células in vitro seria a solução, mas este processo continua limitado e as HSCs acabam por perder a capacidade de se auto-renovarem. A reprogramação directa de células somáticas, mediada por factores de transcrição, abriu novas portas na área da medicina regenerativa de forma a HSCT mais personalizados. Apesar da baixa eficiência, a sobre-expressão dos factores de transcrição Gata2, Gfi1b e cFos permitiu a conversão de fibroblastos em HSCs estabelecendo um novo método de geração de HSCs indicadas para o paciente. Assim, uma melhor compreensão de como o complexo de reprogramação hematopoiética funciona e as interacções entre estes três factores de transcrição com outros componentes do complexo pode fornecer informação importante que permita o aumento da eficiência deste processo de forma a gerar HSCs com maior potencial de transplantação. Neste trabalho, defini os domínios do Gata2 necessários para interagir com o Gfi1b, cFos e com a LSD1/CoREST1 e mais importante, o papel catalítico do complexo LSD1/CoREST durante a reprogramação. Gata2 regula a expressão do gene Kdm1a, co-immunoprecipitações identificaram os domínios necessários para a interacção do Gata2 com os outros dois factores de transcrição, Gfi1b e cFos, mas também com a LSD1/CoREST1. O domínio que contem a sequência de localização nuclear (NLS) do Gata2 parece essencial na interacção com o Gfi1b, mas também com a LSD1/CoREST1, no núcleo. Os zinc fingers localizados no C-terminal e no N-terminal do Gata2 mostraram-se importantes na interação com a LSD1/CoREST1 e com o cFos, respectivamente. cFos também interage com o domínio transactivador do Gata2 no C-terminal, realçando as múltiplas vias necessárias à formação do complexo hemogénico. Esta cooperação entre os factores de transcrição e a LSD1/CoREST1 levanta a hipótese que este complexo pode ser essencial na reprogramação hematopoiética. LSD1 foi inibida farmacologicamente durante a reprogramação de fibroblastos em HSCs. A inibição com dois inibidores estruturalmente diferentes levou à diminuição drástica do processo de reprogramação demostrando que a LSD1 tem um importante papel catalítico durante este processo. Em suma, este estudo identifica as interacções funcionais entre o Gata2, Gfi1b, cFos e a LSD1/CoREST1 e o papel vital deste regulador epigenético durante a reprogramação hematopoiética e aquisição de HSCs. Mais informação sobre a regulação deste complexo hematopoiético pode aumentar a eficiência do processo aproximando esta tecnologia da translação para a clínica.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are able of self-renewal and differentiation into all blood cell lineages. Due to this ability, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) constitutes treatment for a diversity of hematological disorders. Incompatibility between donor and host and the insufficient number of HSCs obtained for transplantation have limited the success of this cellular therapy. To overcome these limitations, expansion of HSCs in vitro has been explored, but this process is a changeling process as HSCs quickly lose stem cell properties upon expansion. Direct reprogramming mediated by transcription factors (TFs) of somatic cells is opening new routes for regenerative medicine and personalized HSCT. Albeit at low efficiency, combined expression of Gata2, Gfi1b and cFos induces reprogramming of fibroblasts into HSC-like cells providing a novel alternative to generate patient-specific HSCs. A better understanding of hemogenic reprogramming and the interactions between these three TFs with each other and with other players will provide valuable information to increase the efficiency of the process and to generate transplantable HSCs that can be used in the clinic. Here, I have defined Gata2 protein domains required to interact with Gfi1b, cFos and LSD1/CoREST1. Gata2 regulates the expression of the Kdm1a gene that encodes LSD1 and co-immunoprecipitations experiments revealed multiple domains required for the interaction of Gata2 with cFos, Gfi1b and LSD1/CoREST1. The nuclear localization sequence of Gata2 is essential for the interaction with Gfi1b but also with LSD1/CoREST1 in the nucleus. C-terminal zinc finger and the N-terminal zinc finger of Gata2 are important for the interaction with LSD1/CoREST1 and cFos, respectively. cFos also interacts with the C-transactivator domain of Gata2, highlighting multiple regulatory pathways involved in the establishment of this “hemogenic complex”. Given this cooperation between TFs and LSD1/CoREST1 I hypothesize that this complex may be essential for the hemogenic reprogramming. LSD1 was pharmacological inhibited during hematopoietic reprogramming into HSC-like cells. Inhibition with two structurally unrelated small molecules led to a drastic decrease of reprogramming efficiency implicating the catalytic function of LSD1/CoREST complex during the hemogenic reprogramming. Overall, this study identified functional interactions between of Gata2, Gfi1b, cFos and LSD1/CoREST1 and the vital role of this epigenetic regulator during hematopoietic reprogramming and acquisition of the HSC fate. This study paves the way for the regulation of this hemogenic complex bringing high-efficiency hemogenic reprogramming one step closer to clinical translation.