Designing Transcription Factors for Efficient Hematopoietic Reprogramming

Abstract

O transplante de células estaminais hematopoiéticas tem sido utilizado como tratamento para uma variedade de doenças hematológicas, devido à capacidade que as células estaminais hematopoiéticas possuem em se de autorrenovarem e se diferenciarem em todas as linhagens de células sanguíneas. No entanto, células em número insuficiente e incompatibilidades entre dadores e receptores dificultam a ampla aplicação desta terapia. Até à data, a expansão de células estaminais hematopoiéticas não foi possível e, por isso, estratégias adicionais para a geração deste tipo de células in vitro são necessárias, de modo a superar as limitações associadas ao transplante. A reprogramação de células somáticas mediada por fatores de transcrição abriu novas portas para a medicina regenerativa e permitiu o surgimento de abordagens para converter um tipo de célula diferenciada diretamente noutro. No sistema hematopoiético, a reprogramação direta de fibroblastos em células semelhantes a células estaminais hematopoiéticas foi obtida através da sobrexpressão dos fatores de transcrição Gata2, Gfi1b e cFos, fornecendo um método alternativo para gerar células autólogas para transplante, in vitro. Uma melhor compreensão do modo de ação destes três fatores, críticos durante a reprogramação, é necessária para aumentar a eficiência do processo.Aqui, eu defini possíveis domínios de reprogramação dos fatores de transcrição hematopoiéticos através da substituição desses mesmo fatores por genes homólogos (parálogos) ou versões com regiões deletadas, durante a reprogramação hematopoiética. Em primeiro lugar, os genes parálogos dos fatores Gata2, Gfi1b e cFos, e versões deletadas do fator Gata2 foram clonados num sistema lentiviral, de forma a direcionar a identidade celular de fibroblastos para a linhagem hematopoiética. Em segundo lugar, a eficiência da reprogramação hematopoiética foi avaliada através da ativação do repórter hCD34/H2BGFP. Curiosamente, Gata1 não substituiu Gata2 na reprogramação hematopoiética, apesar de algumas evidências apontarem para uma sobreposição de funções durante a hematopoiese. Não obstante, Gfi1b e cFos foram parcialmente substituídos por seus respectivos parálogos, indicando um papel determinante dos domínios não homólogos do Gata2 durante a reprogramação. Consistentemente, a reprogramação hematopoiética com versões deletadas do Gata2 revelou a necessidade dos domínios de transativação, do domínio regulatório negativo e do dedo de zinco do C-terminal do Gata2, para uma reprogramação bem-sucedida. Para mais, demonstrei que o Gata2 exibe atividade de marcação mitótica. Esta característica epigenética pode ser importante para a aquisição e manutenção da identidade celular das células estaminais hematopoiéticas, bem como na transmissão do estado celular reprogramado para as células filhas.No geral, este estudo identificou características funcionais dos fatores Gata2, Gfi1b e cFos, para a reprogramação e lança uma nova luz sobre como é adquirida e preservada a identidade celular das células estaminais hematopoiéticas. Daqui em diante, esses módulos de reprogramação serão críticos para o desenvolvimentos de fatores de transcrição/reprogramação melhorados, de modo a aumentar a eficiência de reprogramação hematopoiética, aproximando esta tecnologia da clínica.

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been used as a treatment for a variety of haematological disorders, due to the ability of hematopoietic stem cells (HSCs) to self-renew and differentiate into all blood cell lineages. Insufficient number of cells and matching incompatibilities between donors and recipients hinder the broad application of this therapy. Expansion of HSCs has met limited success and additional strategies for the in vitro generation of HSCs are required to overcome transplant-associated limitations. Somatic cell reprogramming mediated by transcription factors (TFs) is opening new avenues for regenerative medicine and allowed the design of new approaches to convert one differentiated cell type directly into another. In the hematopoietic system, direct reprogramming of fibroblasts to HSC-like cells has been shown through ectopic expression of Gata2, Gfi1b and cFos, providing an alternative method to generate patient tailored HSCs in vitro. A better understanding of the mode of action of these three critical TFs during reprogramming is needed in order to increase the efficiency of the process.Here, I have defined potential reprogramming domains of hematopoietic TFs by homologous gene (paralog) and deletion construct substitution during hematopoietic reprogramming. First, paralogs of Gata2, Gfi1b and cFos and Gata2 deletion constructs were cloned into a lentiviral gene delivery system to induce fibroblast cell identity towards the hematopoietic lineage. Secondly, hematopoietic reprogramming efficiency was assessed by hCD34/H2BGFP reporter activation. Interestingly, Gata1 did not substitute Gata2 for hematopoietic reprogramming, despite evidences of overlapping function during hematopoiesis. Notwithstanding, Gfi1b and cFos were partially replaced by their respective paralogs, indicating a determinant role for non-homologous domains of Gata2 during reprogramming. Consistently, hematopoietic reprogramming with Gata2 deletion constructs revealed the requirement of the transactivation domains (TADs), the negative regulatory domain (NRD) and the C-terminal zinc finger (C-ZF) for successful reprogramming. Remarkably, I have also unveiled that Gata2 display mitotic bookmarking activity. This epigenetic feature may be important for the acquisition and maintenance of the HSC fate as well as the inheritance of the reprogrammed cell state to daughter cells. Overall, this study identified functional reprogramming features of Gata2, Gfi1b and cFos and sheds new light on how the HSC fate is acquired and preserved. Hereafter, these reprogramming modules will be critical for the design of enhanced synthetic TFs to increase hematopoietic reprogramming efficiency bringing this technology one step closer to clinical translation.