Células estaminais do cancro do endométrio: a chave para o tratamento personalizado?

Abstract

Endometrial cancer is the most frequent malignant neoplasm of the female genital tract in Western countries, which affects postmenopausal women and has its peak incidence at the beginning of the sixth decade of life. In general, it presents a favorable prognosis, since the majority of the patients have the diagnosis at an early stage, with disease confined to the uterus. However, up to 20% of endometrial carcinomas present as aggressive neoplasms, such as high-grade lesions or myometrial invasion, with a risk of recurrence. Cancer stem cells (CSC) are characterized as a subpopulation of undifferentiated cancer cells that exhibit self-renewal, differentiation, resistance to conventional therapies and metastatic potential.The aim of this work was the isolation and characterization of an endometrial CSC population and the evaluation of the ALDH pathway inhibition, described as a CSC marker. We intended to study the therapeutic response of CSC to cytostatics used in clinical practice and contribute for clarification of resistance mechanisms. In a translational perspective, using samples from patients with endometrial cancer, it was intended to isolate and evaluate CSC in order to contribute to the development of individualized therapies.The characterization of CSC from endometrial cancer cell lines comprised isolation of sphere-forming populations, evaluation of self-renewal and expression of typical CSC markers (by flow cytometry and Western blot). The influence of ALDH inhibitors on this phenotype was also evaluated. The response to carboplatin, paclitaxel and doxorubicin was evaluated in terms of metabolic activity, expression of proteins involved in resistance to therapy and cell death, as well as DNA damage.The sphere formation protocol was also applied to human tumor samples in order to isolate and characterize CSC population. In parallel, tumor sections were prepared and exposed to the same drugs in order to evaluate the therapy response by immunohistochemistry.The action of the ALDH inhibitor, DEAB, on endometrial CSC populations, in fact, decreased self-renewal and sphere dimensions. RL95-2 spheres submitted to DEAB showed increased expression of CD133. However, other phenotypes associated with CSC, such as CD44+/CD24-, expression of ALDH and P53, were not influenced by the inhibitor.Endometrial CSC populations were more resistant to carboplatin, paclitaxel, and doxorubicin than adherent populations. The parental cell line and the adherent derivatives showed an increase in caspase 3 levels after treatment with carboplatin, accompanied by a decrease in the expression of P53 and ALDH, in adherent populations respectively. Treatment with carboplatin and doxorubicin was significantly more genotoxic in adherent cells than CSC.In human endometrial tumor samples, it was possible to optimize the protocol of spheres isolation and to perform cultures of tumor slices. Expression of CSC markers was most evident in tumors with poor prognosis. From the perspective of defining a personalized response to treatment, there was a variable sensitivity between different tumors. In the future, the prediction of response to therapy, prior to the definition of adjuvant treatment, may become a reality by identifying cytostatics with the best performance in CSC, the minority population responsible for chemoresistance and recurrence.

O cancro do endométrio é a neoplasia maligna do trato genital feminino mais frequente nos países ocidentais, que afeta mulheres habitualmente na pós-menopausa e tem o seu pico de incidência no início da sexta década de vida. Na generalidade, apresenta um prognóstico favorável, dado que a maioria das doentes tem o diagnóstico num estádio inicial, com doença confinada ao útero. No entanto, até 20% dos carcinomas endometriais apresentam-se como neoplasias agressivas, como lesões de alto grau ou com invasão miometrial, com risco de recorrência. As células estaminais do cancro (CSC, do inglês cancer stem cells) caracterizam-se como uma subpopulação de células cancerígenas indiferenciadas que apresentam capacidade de autorrenovação, de diferenciação, de resistência às terapêuticas convencionais e potencial metastático.O objetivo principal deste trabalho foi o isolamento e caracterização de uma população de CSC do endométrio e a avaliação da inibição da via da ALDH, descrita como marcador desta população. Pretendeu-se estudar a resposta à terapêutica das CSC aos citostáticos utilizados na prática clínica e contribuir para esclarecer os mecanismos de resistência. Numa perspetiva translacional, com recurso a amostras de doentes com cancro do endométrio, pretendeu-se isolar e avaliar as CSC de modo a contribuir para o desenvolvimento de terapêuticas individualizadas.A caracterização das CSC de linhas celulares de cancro do endométrio, compreendeu o isolamento de populações com capacidade para formar esferas, a avaliação de propriedades como a autorrenovação e a expressão de marcadores típicos de CSC (por citometria de fluxo e por Western blot). Avaliou-se também a influência dos inibidores da ALDH neste fenótipo. Avaliou-se a resposta aos fármacos carboplatina, paclitaxel e doxorrubicina, em termos de atividade metabólica, expressão de proteínas envolvidas na resistência à terapêutica e morte celular, assim como danos no DNA. O protocolo de formação de esferas também foi aplicado a amostras tumorais das doentes de modo a isolar e caracterizar as CSC. Paralelamente, foram preparadas secções tumorais e expostas aos mesmos fármacos de modo a avaliar a resposta à terapêutica por imunohistoquímica.A ação do inibidor da ALDH, DEAB, nas populações de CSC do endométrio, de facto, diminuiu a autorrenovação e as dimensões das esferas. As esferas de RL95-2 submetidas ao DEAB apresentaram aumento na expressão de CD133. No entanto outros fenótipos associados a CSC, como CD44+/CD24-, a expressão da ALDH e P53, não foram influenciados pelo inibidor. As populações de CSC do endométrio apresentaram maior resistência à terapêutica com carboplatina, com paclitaxel e com doxorrubicina do que as populações aderentes. A linha parental e as derivadas aderentes, apresentaram um aumento dos níveis de caspase 3 após o tratamento com carboplatina, acompanhado de diminuição da expressão da P53 nas células RL95-2 e da ALDH nas derivadas aderentes. O tratamento com carboplatina e doxorrubicina foi significativamente mais genotóxico nas populações aderentes em relação às populações de CSC. Nas amostras de tumores endometriais humanos, foi possível otimizar o protocolo de isolamento de esferas e realizar culturas de fatias de tumor. A expressão de marcadores de CSC foi mais evidente em tumores com pior prognóstico. Na perspetiva de definir uma resposta personalizada ao tratamento verificou-se de facto uma sensibilidade variável entre os diferentes tumores. No futuro, a predição de resposta à terapêutica, prévia à definição do tratamento adjuvante, pode tornar-se uma realidade pela identificação dos citostáticos com o melhor desempenho nas CSC, população minoritária responsável pela quimiorresistência e recorrência.