Impact of an astrocytic pathology on hippocampal memory

Abstract

Os astrócitos são elementos dinâmicos envolvidos na comunicação bidirecional com os neurónios, controlando a atividade neuronal e a função cerebral. Ao interferir com a integridade da rede neurónios-glia no hipocampo, é esperado que haja disfunções, como por exemplo na aprendizagem e na memória. Em condições patológicas, onde a memória está afetada, tal como na doença de Alzheimer, existe cada vez mais a noção de que os astrócitos também possam estar envolvidos no aparecimento e progressão dos défices cognitivos. Para além disso, tem sido proposto que a patologia astrocítica, causada pela gliotoxina ácido L-α-aminoadípico (L-AA) no córtex pré-frontal ou na amígdala medeie perturbações no humor e na cognição. Porém, o papel dos astrócitos na memória, com particular foco no hipocampo, tem sido pouco investigado. O objetivo principal deste trabalho foi investigar o impacto da disfunção dos astrócitos, causada pela gliotoxina L-AA, na memória, bem como nas alterações morfológicas e proteicas dos astrócitos no hipocampo. Assim, para induzir a disfunção astrocítica no hipocampo, administrámos intracerebroventricularmente (icv) L-AA, uma infusão por dia durante três dias consecutivos em murganhos C57BL/6 jovens adultos através de uma cânula que foi implantada num dos ventrículos laterais. De modo semelhante, os animais controlo foram icv administrados com solução salina (PBS). A seguir, os dois grupos de animais foram testados em comportamento, principalmente em testes de memória (testes do reconhecimento do objeto, do deslocamento do objeto, do labirinto em Y modificado e da esquiva inibitória). Posteriormente, foram feitas análises morfológicas e neuroquímicas no hipocampo dos dois grupos de animais. Usou-se secções hipocampais para analisar alterações na morfologia dos astrócitos (através de anticorpos que reconhecem proteínas típicas de astrócitos) por imunohistoquímica, tendo como ponto central identificar alterações ao nível das ramificações (número e tamanho) por microscopia confocal e posterior análise tridimensional da estrutura. Os níveis das proteínas astrocíticas, proteína glial fibrillar acidíca (GFAP), glutamina sintetase (GS), proteína de ligação ao cálcio S100 β e conexina 43 (Cx43) foram também avaliados no hipocampo dos dois grupos de murganhos. Para avaliar se a gliotoxina L-AA afetava os terminais nervosos, quantificou-se também os níveis das proteínas sinápticas (sinaptofisina, SNAP-25 e PSD-95). Os resultados obtidos mostraram que os murganhos administrados icv com L-AA apresentavam défices na memória dependente do hipocampo no teste do deslocamento do objeto (OD) e no teste de labirinto em Y modificado e pareciam apresentar uma maior impulsividade. Além disso, esta gliotoxina reduziu significativamente, em aproximadamente 5–10%, o número de células marcadas positivamente para GFAP, em diferentes sub-regiões do hipocampo (CA1 oriens, CA1 stratum radiatum e CA3) e causou também uma diminuição dos níveis das proteínas astrocíticas (GFAP e Cx43), mas não alterou os níveis das proteínas sinápticas. A análise tridimensional dos astrócitos revelou ainda que murganhos administrados icv com L-AA possuem astrócitos maiores e com maior número de ramificações, sendo a sua complexidade também maior perto do corpo celular. Apesar do presente trabalho ter sido desenvolvido no sentido de validar um modelo animal de patologia astrocítica no hipocampo (estrutura do cérebro envolvida na memória), permitiu também dar uma nova visão sobre o papel dos astrócitos na memória. Este trabalho foi também crucial para evoluir para outros estudos com o objetivo de definir se os astrócitos têm de facto um papel fundamental em doenças com declínio cognitivo, como por exemplo na doença de Alzheimer.

Astrocytes are dynamic signalling elements involved in a bi-directional communication with neurons, controlling neuronal activity and metabolism and, consequently, brain function. Interfering with the integrity of the neuron-glial network in the hippocampus is known to impair integrated responses, like learning and memory. In pathological conditions where memory is impaired, such as in Alzheimer’s disease, there is an increasing recognition for a role of astrocytes in the onset and progression of cognitive deficits. Astrocytic pathology has been proposed to underlie the pathogenesis of mood or cognitive disorders, as heralded by the impact of the gliotoxin, L-α-aminoadipic acid (L-AA) in brain regions, such as prefrontal cortex or amygdala. However, the impact of astrocytes on memory, with a focus in the hippocampus, has been few explored.The major goal of this work was to investigate the impact of astrocytes blunting, triggered by L-AA, on memory and on astrocytic morphology and proteins in hippocampus. Thus, to induce a condition of astrocytes blunting in hippocampus we administrated intracerebroventricularly (icv) L-AA, one single infusion for three consecutive days in young adult C57BL/6 mice using cannula guides implanted in one of the lateral ventricles. Similarly, the control group of animals were icv administrated with saline solution (PBS, LAA-vehicle). Then, these two groups of animals were behaviourally tested, mainly regarding memory performance (object recognition, object displacement, modified y-maze and step-down inhibitory avoidance tests). Afterward, we performed morphological and neurochemical analyses of the hippocampus of described experimental animal models. Therefore, we used hippocampal sections to analyze alterations in astrocytes morphology (immunolabelling of astrocytic markers) by immunohistochemistry, with the particular focus on identifying alterations in astrocytic processes (number and length) using confocal microscopy and further analysis of tridimensional structure. In addition, we quantified the levels of hippocampal astrocytic proteins, glial fibrillary acidic protein (GFAP), glutamine synthetase (GS), S100 calcium binding protein β (S100β) and connexin 43 (Cx43) in the two animal groups, by Western blot analysis. To check out whether the gliotoxin L-AA was affecting nerve terminals, levels of synaptic markers (synaptophysin, SNAP-25 and PSD-95) were also quantified. Our results showed that icv infused L-AA mice exhibited a reduced hippocampal memory performance, in the object displacement (OD) test and in the modified y-maze test and seemed had an enhanced in impulsivity. Moreover, this gliotoxin significantly decreased the number of GFAP-positive cells, by about 5–10%, in different subregions (CA1 oriens, CA1 stratum radiatum and CA3) of the hippocampus and caused a reduction in the levels astrocytic proteins (GFAP and Cx43) but had no effect in synaptic proteins. Furthermore, the tridimensional analysis of astrocytes revealed that in mice icv infused with L-AA, the hippocampal astrocytes exhibited a significant increase in the number and in the total length of processes (or ramifications), being the complexity of the processes higher near the cell body.Although the present work was designed to validate an animal model of astrocytes pathology in the hippocampus, a brain structure involved in memory processing, it also gave novel insight about the role of astrocytes in memory. Furthermore, it will be crucial to evolve to other studies in which the focus is the definition of whether astrocytes have a key role in brain-disorders associated with cognitive decline, such as Alzheimer´s disease.