Modelling Machado-Joseph disease: from induced pluripotent Stem Cells to mature neuronal subtypes

Abstract

Machado-Joseph disease (MJD) or Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) is the most common autosomal dominant neurodegenerative disease in the world and although it is a rare disease, it is relatively prevalent in Portugal, especially in the Azores. MJD is a late-onset neurodegenerative disease caused by a cytosine-adenine-guanine (CAG) trinucleotide expansion, resulting in an abnormal polyglutamine tract within the ataxin-3 (ATXN3) protein which has toxic functions causing neuronal dysfunction and cell death, mainly in the cerebellum, resulting in a progressive impairment of the coordination of voluntary movements and others motor and postural symptoms that aggravate progressively, and therefore make it a fatal disease. Despite current efforts, there are no MJD's effective therapies which constitute a challenge to fight against the disease.Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has appeared as a significant approach to understanding, and potentially reversing, disease pathology. The capability to reprogram somatic cells to iPSCs offers an opportunity to generate pluripotent patient-specific cell lines that can benefit human model diseases. Pluripotent stem cells can differentiate into all three germ layers, having the possibility to originate all cells of the human body. To direct differentiate iPSCs towards neurons it is necessary a long and complex protocol based on a progressive regionalization, under the control of temporally and spatially coordinated gradients of patterning factors and morphogens that mimics in vivo central nervous system (CNS) mammalian development.In divergence to other neurodegenerative diseases, few studies have prospered in generating iPSC-based cerebellar ataxias models. Additional work may be needed to improve conditions to differentiate human iPSCs or embryonic stem (ES) cells to cerebellar neurons. Considering these subjects, the mainly purpose of this study was to find out the best experimental conditions to differentiate healthy subjects and MJD patient derived iPSCs into cerebellar neurons, contributing to understand disease pathology by defining specific cerebellar patterning culture conditions in order to generate an innovative platform for disease modelling, drug screening and cell-replacement therapies.To perform cerebellar neuronal differentiation, neural progenitor cells were generated from healthy and MJD iPSCs via two different experimental protocols, based on the exogenous application of patterning factors and morphogens that induce specific cellular regionalization of cerebellum development, and we search the presence of cerebellar structures in cultures from control and MJD-derived iPSCs lines generated in vitro. In the present study we demonstrated that these experimental protocols performed in iPSCs derived from control and MJD patients allowed the development of a specific cerebellar patterning that resulted in differentiated cerebellar neural-like cells, an outcome that was obtained upon cellular and molecular assays. Thus, when specific cerebellar differentiation protocols are applied, in time and concentration specific manner, healthy subjects and MJD patients derived iPSCsleads to the generation of neurons with caudal and cerebellar identity.In conclusion, the present work provided evidences that MJD patient-derived iPSCs are a powerful tool that provides a unique opportunity to generate MJD patient-specific neurons, allowing the study of the cerebellar ataxia pathophysiology. In addition, iPSCs technology combined with neuronal differentiation protocols offers great opportunities to gain insight into the genetic basic of neurological disease, specially to Machado-Joseph disease.

A Doença de Machado-Joseph (MJD do inglês Machado-Joseph Disease) ou Ataxia Espinocerebelosa do tipo 3 é uma a doença neurodegenerativa autossómica dominante mais comum no mundo e, embora seja uma doença rara, é relativamente prevalente em Portugal, especialmente nos Açores. A MJD é uma doença neurodegenerativa tardia causada por uma expansão da repetição do trinucleótido citosina-adenina-guanina (CAG), que resulta num tracto de poliglutamina anormalmente longo presente na proteína ataxina-3 (ATXN3), apresentando funções tóxicas que causam disfunção neuronal e morte celular, principalmente no cerebelo, resultando num comprometimento gradual da coordenação dos movimentos voluntários e outros sintomas motores e posturais que agravam progressivamente e, portanto, tornando a doença fatal. Apesar dos esforços atuais, não há terapias efetivas para a MJD, resultando num desafio e obstáculo para combater a doença.A tecnologia das células estaminais pluripotentes induzidas (do inglês induced-pluropotent stem cells - iPSCs) tem aparecido como uma abordagem significativa para compreender e, potencialmente, inverter a patologia da doença. A capacidade de reprogramar células somáticas para células pluripotentes oferece uma oportunidade para gerar linhas celulares pluripotentes específicas para o doente e que podem ser usadas para produzir modelos de doença. As iPSCs podem diferenciar-se nos três folhetos germinativos, tendo a possibilidade de originar todas as células do corpo humano. Para direcionar a diferenciação destas células para neurónios, é necessário um protocolo longo e complexo baseado numa regionalização progressiva, através do controlo temporal e espacial de fatores de padronização e de moléculas que mimetizam o desenvolvimento in vivo do sistema nervoso central.Em divergência com outras doenças neurodegenerativas, poucos estudos prosperaram na geração de modelos de ataxia cerebelar baseados em iPSCs. É necessário um trabalho adicional para melhorar as condições de diferenciação entre as células pluripotentes induzidas humanas ou células estaminais embrionárias para neurónios do cerebelo.Considerando estes tópicos, o principal objetivo deste estudo foi descobrir as melhores condições experimentais para diferenciar iPSCs derivadas de indivíduos saudáveis e de doentes com MJD em neurónios cerebelares, contribuindo para a compreensão da patologia da doença por meio da definição de condições específicas de cultura cerebelar para gerar uma plataforma inovadora para modelos de doenças, desenvolvimento de fármacos e terapias de substituição celular.Para realizar a diferenciação cerebelar, as células progenitoras neurais foram geradas a partir de iPSCs de indivíduos saudáveis e de doentes com MJD através de dois protocolos experimentais diferentes, baseados na aplicação exógena de fatores de padronização e morfogénicos que mimetizam o desenvolvimento embrionário do Sistema Nervoso Central in vivo, e investigámos a presença de estruturas cerebelares nas culturas geradas in vitro.No presente estudo, demonstrámos que estes protocolos experimentais realizados em iPSCs derivadas de pessoas saudáveis e de doentes com MJD permitiram o desenvolvimento de um padrão cerebelar específico que resultou em diferenciação de células semelhantes a neurónios cerebelares, um resultado que foi obtido através de ensaios celulares e moleculares. Assim, quando protocolos específicos de diferenciação cerebelar são aplicados, de acordo com um tempo e concentração específicos, as iPSCs derivadas de pessoas saudáveis e de doentes com MJD levam à geração de neurónios com identidade caudal e padrões cerebelares.O presente trabalho mostrou evidências de que as iPSCs derivadas de doentes com MJD são uma ferramenta poderosa que fornece uma oportunidade única para gerar neurónios específicos, permitindo o estudo da fisiopatologia de ataxias cerebelares. Além disso, a tecnologia destas células pode ser importante para o desenvolvimento de medicamentos, modelos de doenças e terapias de substituição de células.Em conclusão, o presente trabalho forneceu evidências de que as iPSCs derivadas de doentes com MJD são uma ferramenta poderosa que oferece uma oportunidade única para gerar neurónios específicos de doente com MJD, permitindo o estudo da fisiopatologia da ataxia cerebelar. Além disso, a tecnologia de iPSCs combinada com protocolos de diferenciação neuronal oferece grandes oportunidades para obter informações sobre a base genética de doenças neurológicas, especialmente para a doença de Machado-Joseph.